研究背景中波紫外线(UVB)是导致皮肤日晒伤、光老化及皮肤癌的重要因素。表皮中的角质形成细胞是UVB照射的重要靶细胞。长期反复的UVB辐射可引起皮肤细胞,主要是表皮细胞的损伤,导致一系列皮肤不良反应如红斑、水肿、水疱、皮肤色素沉着、异常增生、光老化、癌前病变如光化性角化病等,最终将导致皮肤癌的发生。UVB引起的急性光损伤包括细胞增殖活性降低、凋亡增加,光产物嘧啶二聚体形成等。NPM1基因与DNA修复、细胞增殖、凋亡和肿瘤形成等调控密切相关,在UV辐射引起的细胞反应中起着重要的调控作用。生命科学已进入了后基因组时代,蛋白质组学是研究细胞、组织或机体在特定的时间和空间上基因组活跃表达的全部蛋白质的科学。它是在蛋白质水平定量、动态、整体的研究生物体,并由此在更深层次上获得对生理、疾病过程以及调控网络的广泛而完整的认识。RNA干扰技术属于反向遗传学研究手段,已成为研究基因功能的良好工具。相对于基因敲除技术来讲,RNA干扰整个流程设计更简便,且作用迅速,效果明显,为基因治疗开辟了一条新途径。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是绿茶主要活性成分,具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等广泛的药理作用。我们已证实EGCG能减少紫外线引起的皮肤细胞(包括人角质形成细胞、人成纤维细胞等)的光损伤,减少炎症因子分泌和光产物的生成。NPM基因与DNA修复、细胞增殖、凋亡和肿瘤形成等调控密切相关。但关于EGCG对UVB照射前后表皮细胞的蛋白组变化以及NPM在光损伤中的作用目前还研究甚少。目的应用蛋白质组学双向凝胶电泳和质谱技术研究在EGCG和UVB照射干预对人表皮角质形成细胞HaCaT株差异表达蛋白的影响,以进一步阐明和探索EGCG具有的生物学活性和防光效应机制。进而通过特异性siRNA沉默NPM1基因表达,随后对细胞凋亡和增殖活性变化等进行观察分析,以明确NPM1基因在人皮肤光损伤发生进程中的功能和作用机制。方法1.细胞培养:以含10%小牛血清的RMPI-1640培养基培养HaCaT细胞(永生化人角质形成细胞株),定量接种于96孔板、6孔板或10cm培养皿中。2.药物配制:以DMSO溶解EGCG,贮存液浓度50mg/ml,分装贮存于-20℃冰箱,EGCG的实验终浓度为50μg/ml。3.紫外线照射:根据实验设计定时定量以UVB照射培养细胞并加入EGCG进行干预处理。4.固相pH梯度双向凝胶电泳技术进行分离蛋白,经ImagingMaster 2D软件分析以发现差异表达蛋白。5.对部分差异表达蛋白进行基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALD I2TOF)质谱分析,测定其肽质量指纹图谱。6.用Mascot查询软件搜寻Swiss-prot数据库鉴定蛋白质。7. Western blot方法检测30mJ/cm2UVB照射后NPM1蛋白的表达水平。8.构建NPM1的siRNA靶序列,转染细胞,实时定量PCR法检测NPM沉默效率。9. MTT法检测EGCG及siRNA干扰对UVB诱导HaCaT细胞增殖活性的变化。10.流式细胞仪检测EGCG及siRNA干扰对UVB诱导HaCaT细胞凋亡的变化。11.统计分析:实验数据用SPSS分析。当P< 0.05时差异有统计学意义。结果1.EGCG组与对照组比较发现42个差异表达蛋白点,从中随机抽取部分(16个)蛋白点进行肽质量指纹谱鉴定。其中9个点经EGCG孵育后在HaCaT细胞中高表达,4个点在EGCG孵育后的HaCaT细胞中低表达。2.在UVB辐射前后加入EGCG进行干预可明显抑制UVB辐射引起的HaCaT细胞蛋白质组变化,23个UVB下调蛋白点受EGCG作用表达上调,而30个UVB上调蛋白点受EGCG作用表达下调。3.设计合成NPM特异性siRNA片段转染至HaCaT细胞中并通过Real-time PCR法检测NPM mRNA表达水平,以NPM-915-siRNA转染48h沉默效率最高,选取该siRNA片段和转染时间点进行下一步实验。4.与对照组比较,UVB照射可明显抑制HaCaT细胞增殖活性,诱导细胞凋亡; siRNA干扰特异性沉默NPM蛋白后细胞增殖活性下调,细胞凋亡率升高;加入EGCG预处理可以改善细胞增殖活性,细胞凋亡率明显下降。结论UVB辐射可引起HaCaT细胞大量蛋白差异表达,EGCG可明显抑制UVB引起的蛋白质组差异表达变化。UVB可诱导HaCaT细胞损伤,表现为细胞生长活性被抑制。而在UVB照射后加入EGCG可有效保护HaCaT细胞免于UVB损伤进程,其具体机制可能与调控NPM基因表达有关。这些结果将为我们从全面理解UVB致表皮细胞损伤过程以及进一步研究EGCG在蛋白质分子水平的抗紫外线损伤作用机制提供了新的证据。