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目的：构建并表达纯度较高的抗CD133xCD3双特异性抗体,通过体内及体外实验检测其对结直肠癌细胞的靶向杀伤效应,并探讨其可能的作用机制,期待为晚期结直肠癌患者找到一种更安全有效的治疗方法。方法：1.利用基因重组技术构建人鼠嵌合型抗人CD133xCD3双特异性抗体(MS133)及抗人CD133单克隆抗体(AC133)。2.利用瞬时转染表达MS133及AC133,通过Protein A亲和层析和SP阳离子交换层析纯化抗体,Western blot检测蛋白表达,SDS-PAGE和SEC-HPLC检测抗体纯度。3.通过流式的方法检测MS133分别与细胞表面抗原位点CD133和CD3的结合能力,并利用CFSE、PI染料进行细胞染色,检测MS133包被激活的T细胞(activated T cell, ATC)对结直肠癌细胞(HCT116、HT29.SW480)的杀伤情况和对正常组织细胞MCF-10A的毒性效应。4.选取CD133高表达细胞株HCT116为研究对象,使用CCK8试剂盒检测MS133对其增殖的影响,并通过定量ELISA的方法检测细胞杀伤过程中相关细胞因子(IFN-y、TNF-a、GM-CSF、IL-4)的分泌情况。5.为了验证MS133的体内药效,我们建立了两种重症免疫缺陷小鼠(NOD/SCID)动物模型,首先是MS133包被ATC细胞与HCT116细胞混合共注射模型；更进一步验证是将HCT116细胞与ATC细胞混合接种于小鼠皮下,尾静脉抗体(MS133、hOKT3、hIgG)给药模型。结果：1.制备的双特异性抗体MS133分别用SDS-PAGE和SEC-HPLC检测,纯度为84%和95%,抗体产量约为10mg/L。2. MS133与CD3阳性细胞(Jurkat、ATC)和CD133阳性细胞(HCT116、HT29)均能很好的结合。MS133包被ATC细胞可高效杀伤CD133高表达结直肠癌细胞株HCT116和HT29,对CD133低表达结直肠癌细胞株SW480及正常组织细胞株MCF-10A杀伤作用弱。3.在效应细胞与靶细胞比例较高时,MS133表现出显著的HCT116增殖抑制效应。另外,MS133靶向杀伤HCT116过程中,产生较高水平IFN-y、GM-CSF细胞因子的分泌。4.小鼠体内实验中,MS133包被ATC细胞可完全抑制小鼠移植瘤的生长；此外,低剂量MS133注射可显著抑制小鼠移植瘤的生长,瘤体积及瘤重均小于单抗治疗组,并且小鼠体重未出现明显变化。结论：1.MS133体外包被激活的T细胞可有效杀伤CD133高表达结直肠癌细胞,杀伤作用的强弱与细胞表面CD133表达水平相一致。2.MS133包被ATC细胞可特异性杀伤CD133高表达结直肠癌细胞,并且对CD133低表达的结直肠癌细胞和正常组织细胞毒性作用较小。3.MS133介导ATC细胞靶向杀伤CD133高表达结直肠癌细胞HCT116的同时,IFN-r和GM-CSF分泌量也明显增加,可能是MS133高效杀伤肿瘤细胞的一个机制。4.小鼠体内实验证实,MS133介导ATC细胞的靶向杀伤能够有效抑制小鼠HCT116移植瘤的生长。因此,MS133作为一种新的治疗性抗体,对于靶向治疗晚期结直肠癌具有良好的应用潜能。