二吡啶酮腙二硫代丁酸通过Stub1介导的p53自噬性降解阻断p53/EGFR/AKT信号通路抑制人食管癌细胞系的生长

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背景我国食管癌发病率和死亡率均居世界首位。90%患者确诊时已处于中晚期,化疗是治疗的重要方法之一,但顺铂、奥沙利铂等常用药存在疗效有限、不良反应较为严重等问题,化疗药物的研发依然是研究的热点。研究发现癌组织中铁、铜含量高于其他组织,癌细胞的增殖和转移时对金属离子如铁、铜和锌的需求增加,使得螯合剂使用成为新的抗癌策略。二硫代氨基甲酸盐是一类对金属离子具有强螯合能力的含硫化合物,其衍生物吡咯烷二硫代氨基甲酸盐具有抗肝癌活性,二吡啶酮腙二硫代丁酸(Dpdtb A)对胃癌细胞的生长抑制机理已获得初步认知,但与食管癌细胞的生长抑制关系有待探究。目的评价二吡啶酮腙二硫代丁酸(Dpdtb A)对EGFR高表达的人食管癌细胞系KYSE450和KYSE 150生长的影响。探讨其机制,判断是否影响EGFR相关分子。方法1.常规培养人食管癌KYSE150和KYES 450细胞。2.MTT、集落形成、形态学观察来评估Dpdtb A对细胞的生长抑制作用,确定机制研究的药物浓度。3.机制研究中以Dmso组为对照,加入Dmso使其终浓度为0.7%,实验组主要为5μM组和10μM组,加入Dpdtb A药物,使其终浓度分别为5μM和10μM。药物作用24小时后,收取细胞进行后续检测。4.PI、Annexin V/FITC、DCFH-DA染色的流式细胞技术分别检测细胞周期、细胞凋亡、细胞ROS的变化。5.WTS-8法检测总SOD酶活性的变化。6.Western Blot检测CDK2、BAX、Bcl-2、NCOA4、Ferritin、SOD、p53、p-p53、Stub-1、EGFR、p-EGFR、AKT、p-AKT、LC-3、MDM2的变化。7.RT-PCR检测p53 m RNA的改变。8.使用SPSS16.0和Graphpad Prism 7软件进行分析,实验数据用均数±标准差((?)±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,检验水准α=0.05。结果1.Dpdtb A对细胞均能抑制生长,KYSE 450细胞的IC50为5.497±0.53μM,KYSE 150细胞的IC50为5.005±0.39μM;0.5μM的Dpdtb A作用10天后,细胞集落数少于Dmso组(p<0.05)。Dpdtb A作用24小时后,细胞密度降低、皱缩变圆、出现漂浮;5μM、10μM Dpdtb A组均有细胞存活。2.Dpdtb A诱导KYSE 450和KYES 150细胞周期S期阻滞,且随着药物浓度的增大,S期细胞所占的比率增大(p<0.05)。Dpdtb A作用后细胞CDK2蛋白含量减少,且随着药物浓度的增大,减少越明显(p<0.05)。3.Dpdtb A使KYSE 450和KYES 150细胞的凋亡率增多,随着药物浓度的增大,细胞凋亡率升高越明显(p<0.05)。Dpdtb A减少KYSE 450细胞的Bcl-2表达(p<0.05),BAX表达改变不明显(p>0.05),10μM组细胞的BAX/Bcl-2比值高于DMSO组(p<0.05);KYSE 150细胞的BAX和Bcl-2表达均减少(p<0.05),Dpdtb A组BAX/Bcl-2比值低于DMSO组(p<0.05)。4.Dpdtb A诱导KYSE 450和KYES 150细胞ROS增多,随着药物浓度的提高,ROS增多更明显(p<0.05)。在KYSE 450细胞中,NCOA4下调、Ferritin上调(p<0.05);细胞内总SOD酶活性降低和SOD蛋白含量降低(p<0.05)。5.Dpdtb A作用KYSE 450和KYES 150细胞后,EGFR和p-EGFR含量降低,且随着浓度的增加抑制更明显(p<0.05);EGFR的上游信号分子p53和下游信号分子AKT的表达都受到了抑制,且随着浓度的增加抑制更明显(p<0.05)。6.Dpdtb A引起KYSE 450和KYES 150细胞的p53 m RNA上升(p<0.05)。7.Dpdtb A使KYSE 450和KYES 150细胞MDM2蛋白含量也下降,且随着药物浓度的增加下降更明显(p<0.05);加入蛋白酶体抑制剂MG132后,细胞p53和MDM2蛋白含量依然下降(p<0.05)。8.Dpdtb A引起KYSE 450和KYES 150细胞的Stub-1的降低和p-p53含量升高,且随着浓度的增加作用越明显(p<0.05),加入自噬抑制剂3-MA可以减弱Dpdtb A的作用(p<0.05)。9.Dpdtb A使KYSE 450和KYES 150细胞Lc3的含量上升,Stub-1、p53含量下降,EGFR、AKT、p-AKT也下降(p<0.05);加入自噬抑制剂3-MA和氯喹后,Stub-1、p53含量回升,EGFR、AKT、p-AKT也回升(p<0.05)。结论Dpdtb A能够抑制人食管癌KYSE 450和KYSE 150细胞的增殖,其机制可能是Dpdtb A引发Stub1介导的p53蛋白自噬降解并使p53/EGFR/AKT信号通路失活、促进p53蛋白磷酸化、降低细胞内SOD酶活性导致细胞ROS积累,诱导细胞凋亡,并使细胞周期阻滞在S期。
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