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研究背景创伤后的创面感染以及全身性感染是创伤患者常见的并发症,也是导致患者死亡的重要因素之一。目前尽管通过积极抗休克补液、创面手术清创、合理抗生素应用、营养支持、免疫调节等治疗手段,明显降低了创面感染病死率。然而,随着日益增加的微生物多重耐药性,创伤后感染仍然是创伤治疗与研究领域所面临的重要难题之一。近几十年来,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的出现给创伤病人尤其是重度创伤感染患者的治疗带来严重挑战。MRSA是引起院内感染的常见致病菌之一,并可与其他耐药菌、机会感染菌形成混合感染,导致皮肤软组织感染、移植皮肤坏死、肺炎、关节炎、心内膜炎、脓毒症等,严重的MRSA感染可最终引起多器官功能障碍导致患者死亡。MRSA可在医护人员与病人、以及病人与病人之间传播,易于发生暴发流行,且难于控制。MRSA分离率逐年上升,耐药谱不断扩大,新的耐药菌株不断出现,MRSA感染俨然成为一个全球性难题。因此开发新的MRSA治疗策略成为一种重要趋势,其中光动力抗菌化学疗法(PACT)是近几年出现的最具有前景的治疗方法之一。PACT治疗通过光激发光敏剂产生单线态氧等细胞毒性物质杀灭微生物,目前多数光敏剂缺乏选择性,在作用于目标微生物的同时可损伤机体正常组织细胞、并降低了对靶细胞的杀菌效能,这是PACT治疗的重要缺陷之一。本研究拟利用MRSA特异性表达β-内酰胺酶的特点,设计结构中含有β-内酰胺环的新型功能型光敏剂LAEtNBS,以提高其介导的PACT对MRSA的选择性,降低对正常组织及正常菌群的影响。研究方法1.设计并合成新型的功能型光敏剂LAEtNBS及其理化性质分析。首先合成阳离子光敏剂EtNBS-COOH, EtNBS-COOH是吩噻嗪类光敏剂EtNBS侧链羧基化后的产物,EtNBS-COOH分子上的-COOH可用来进行后续合成时与氨基反应。LAEtNBS是将EtNBS-COOH和淬灭剂BQH3分别连接到p-内酰胺类抗生素分子ACLE的两端侧链上,这两个连接均通过EtNBS-COOH和BQH3分子上的-COOH与ACLE分子侧链上的两个-NH2反应实现。合成并纯化得到LAEtNBS和EtNBS-COOH后,对二者进行吸收光谱、荧光光谱分析,继而对相对荧光产生量和单线态氧产生量这两个与光动力学治疗相关的重要性质进行分析比较。2.体外实验分析LAEtNBS和EtNBS-COOH对MRSA及MSSA的PACT作用,以及对皮肤组织细胞的光动力学副作用。比较不同浓度的LAEtNBS和EtNBS-COOH分别对体外培养的MRSA和MSSA在640±10nm、15 J/cm2照射下PACT杀菌作用差异,分析经过结构修饰的LAEtNBS是否对MRSA具有选择性杀菌作用；其次利用CCK-8细胞增殖分析方法评价LAEtNBS和EtNBS-COOH对皮肤成纤维细胞和角质形成细胞的生长抑制作用。3.在体创面感染模型上验证LAEtNBS和EtNBS-COOH杀菌、促进创面愈合的作用。小鼠皮肤全层皮肤缺损创面接种MRSA,1天后创面分别应用LAEtNBS、 EtNBS-COOH.及PBS对照,并以640土10 nm、90 J/cm2照射进行PACT;比较三组不同处理创面的愈合时间、速度,创面细菌数量变化、血液细菌培养,以及组织学分析,评价LAEtNBS是否可减少创面MRSA、加快创面愈合。研究结果1. LAEtNBS结构改变未明显改变其中光敏剂分子EtNBS的吸收光谱峰值(655nm,比EtNBS-COOH 650 nm略有红移)和波形,但明显降低了荧光光谱的峰值；与EtNBS-COOH比较,LAEtNBS相对荧光产生量明显降低(约为EtNBS-COOH的9.5%),相对单线态氧产生量下降为EtNBS-COOH的47.8%。2.2.5μM、5μM的LAEtNBS对MRSA的杀菌效果明显强于相同浓度、相同光照强度下其对MSSA的杀菌效能；而EtNBS-COOH在各个浓度下,相同光照强度引起的MRSA和MSSA杀菌效能没有明显差异。另外,相同浓度和光照条件下,LAEtNBS对皮肤成纤维细胞及角质形成细胞的生长抑制作用小于EtNBS-COOH。3.小鼠创面MRSA感染模型上,200μM的LAEtNBS进行光照50 mW/cm2照射30 min可显著减少创面MRSA数量,减轻创面组织炎症细胞的大量侵润,缩短创面愈合的时间,且未发生全身性感染；LAEtNBS组与相同浓度相同光照的EtNBS-COOH处理组,在减少创面MRSA数量、加快创面愈合无统计学差异；以LAEtNBS及EtNBS-COOH进行的PACT减少创面MRSA数量与创面温度升高无关。研究结论新型光敏剂LAEtNBS利用β-内酰胺酶的识别和激活作用,可一定程度上选择性杀灭MRSA,减少对不表达β-内酰胺酶的MSSA及组织细胞毒性副作用。LAEtNBS这种利用目标微生物特异表达的产物、提高PACT特异性的策略,可协同抗生素等手段治疗多重耐药细菌感染,具有潜在的临床应用价值。