炎症反应是机体维持自身稳态的重要调控手段,与抗感染宿主反应、组织损伤修复及慢性炎症性疾病发生都密切相关。而类风湿性关节炎(Rheumatoidarthritis,RA)是一类典型的由于机体免疫系统过度激活而引起的慢性自身免疫性疾病,主要临床表现为持续性关节滑膜炎症,并伴随包括中性粒细胞在内的大量免疫细胞浸润,造成关节软骨和骨的损伤。目前对于RA的致病机理、病理过程及治疗手段尚未完全研究清楚,因此RA局部炎症反应的激活和调控过程一直是该领域研究的热点。研究表明,RA的发生与炎症反应的过度激活密切相关,并且这个过程受到多种内源性分子的调控。科学家近年来发现了其中一类被称为“危险信号”(danger signal)的内源性分子在疾病发生、发展中发挥着重要作用,其过度和慢性释放能够导致关节异常炎症和软骨破坏。这些来自不同关节免疫细胞的内源性分子,能够在细胞外环境中创建并形成反馈回路的网络,放大关节的损伤和局部炎症反应。在RA中,常见的“危险信号”包括HMGB1、HSP、IL-33和胞外核苷酸等,当被释放到细胞外环境时,这些介质可能在同一细胞上交联不同的受体,同时激活免疫细胞内的许多信号传导途径,导致破坏性炎症反应发生。因此,未来RA的预防和治疗策略的发展可能取决于对这些“危险信号”及相关信号通路的早期检测和抑制,所以胞外“危险信号”在RA局部炎症中的功能和调控机制的研究具有重要的研究价值和应用潜力。腺苷二磷酸(ADP)是“危险信号”胞外核苷酸家族的重要成员之一,在体内丰度较高,是ATP的主要次级代谢物;其在血小板活化、集聚过程中发挥重要功能,并能参与血小板介导的炎症反应。我们的前期研究也发现胞外ADP作为一种“危险信号”在炎症和组织损伤时能够被大量释放出来。那么,RA发展过程中是否存在ADP释放的现象?关节组织中释放的ADP能否调控局部炎症的发生?ADP在RA疾病发展中发挥了哪些重要的功能?本研究拟针对这些问题,阐释胞外ADP在RA发生过程中对局部炎症的反馈调控功能和分子机制,为靶向“危险信号”相关药物的开发和应用提供理论基础和实验支持。首先,我们研究了胞外ADP作为一种细胞间信号传递分子在RA局部炎症中的功能。不仅在细胞炎症模型上,而且在RA小鼠模型的关节组织中都检测到了 ADP的释放,并呈现反应快、浓度高的特点;RA病人组织中ADP受体P2Y1的表达量也是显著升高的。之后,我们构建RA小鼠模型进一步研究胞外ADP在RA病理过程中发挥的功能,发现ADP组小鼠在临床评分、关节厚度和肿胀程度等方面均显著高于对照组;在炎症关节局部,ADP显著影响关节组织病理形态,促进炎性中性粒细胞的浸润,加重局部炎症反应。在体内,使用P2Y1敲除小鼠建立RA模型,敲除小鼠的临床发病程度明显减轻,关节红肿消退;并且使用P2Y1特异性拮抗剂治疗模型小鼠后,可轻微抑制小鼠的关节肿胀,ADP促进中性粒细胞浸润到炎症关节中的现象也被明显阻断。表明胞外ADP可作为一种“危险信号”促进炎性中性粒细胞浸润,加剧RA关节局部炎症反应。我们进而对胞外ADP诱导中性粒细胞浸润的调控功能进行探究。通过对ADP处理过的骨髓来源巨噬细胞进行基因芯片分析,我们发现了大量在ADP刺激后出现差异表达的基因,而GO富集分析显示这些基因可能与激活中性粒细胞的趋化迁移的生物过程有关。在这基础上,利用体内细胞迁移模型进一步证实了胞外ADP可以影响中性粒细胞向炎症部位迁移的能力;同时在体外Transwell实验中发现了 ADP诱导的巨噬细胞上清具有很强的趋化中性粒细胞的能力。并且发现ADP诱导组织巨噬细胞分泌的趋化因子CXCL-2在这个过程中发挥关键作用,体内、体外模型中用特异性CXCL-2抗体阻断CXCL-2的作用,可明显抑制中性粒细胞的迁移趋化能力。与此同时,我们证明了巨噬细胞与CXCL-2共定位在RA小鼠关节组织中,揭示了巨噬细胞分泌的CXCL-2在ADP加剧的RA局部炎症中的关键作用。最后对ADP诱导CXCL-2的转录调控机制进行了研究。我们首先通过常用生物信息学软件预测可能参与ADP调控的转录因子结合位点,经过双荧光素酶报告基因、特定位点突变等方法的比对和筛选,我们发现了 ADP能够诱导巨噬细胞中重要的转录因子NF-κB进入细胞核,与CXCL-2启动子区结合,促进其基因的转录和表达。进而,通过钙流检测实验,我们发现ADP主要激活P2Y1受体,偶联Gaq提高胞内Ca2+信号,进一步功能实验证实了抑制Ca2+信号后ADP诱导巨噬细胞CXCL-2的分泌量下降。总之,这些结果基本阐释了胞外ADP调控巨噬细胞表达CXCL-2参与炎症反应调控的分子机制。综上所述,我们的结果证实了 ADP作为胞外“危险信号”在RA局部炎症中的重要作用,并探究了发挥功能的病理作用和分子机制,为包括RA在内的相关炎症性疾病的预防和治疗提供了新的线索。