牙周炎是一种发生在牙周组织的常见感染性疾病,主要症状为牙龈萎缩,附着丧失,牙骨质、牙周膜的破坏。炎症的不断进展最终将引起牙槽骨的吸收并最终导致牙齿脱落。目前临床通用的牙周炎治疗方法虽然可以很大程度上去除病因阻止牙周炎恶化,但受损的牙周组织却因有限的自我修复能力而无法复原,这是目前牙周炎诊疗中面临的难题。因此,如何有效实现完整的牙周组织再生是现在牙周组织工程学研究的重要方向。牙周组织工程学的研究对象主要包括种子细胞,生物载体支架以及微环境,其中,种子细胞——牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)的增殖和分化是牙周组织再生的生物学基,而细胞外基质(extracellular matrix,ECM)微环境是维持干细胞干性的重要因素。因此,不同组织特异性ECM势必会影响PDLSCs的成骨分化,而这方面的研究尚不明确。另一方面,近期的许多研究发现,P2X7受体在多种组织来源的间充质干细胞向成骨细胞分化过程发挥重要作用,这提示P2X7很可能参与ECM微环境对PDLSCs成骨分化的影响。因此,本课题通过体外制取人牙周膜细胞和骨髓细胞的ECM,模拟不同的h PDLSCs成骨分化微环境;观察组织特异性ECM对h PDLSCs生物学特性的影响;随后对h PDLSCs成骨分化与其细胞表面P2X7受体表达进行检测,并明确该受体在h PDLSCs成骨分化中发挥的作用;最后在骨髓ECM微环境中对P2X7受体和h PDLSCs的成骨分化关系进行深入分析,希望能够进一步明确P2X7受体在ECM促进h PDLSCs成骨分化的作用。研究内容:1.组织特异性ECM在牙周膜干细胞成骨分化中作用的研究。2.P2X7受体在h PDLSCs成骨分化中作用的研究。3.P2X7受体在ECM促进牙周膜干细胞成骨分化过程中作用的研究。研究方法:1.观察不同组织来源的ECM对h PDLSCs成骨分化的影响。体外脱细胞处理人颌骨骨髓细胞和牙周膜细胞,制备组织特异性ECM。分离培养鉴定h PDLSCs,之后将h PDLSCs分别接种在h PDLCs-ECM,h BMCs-ECM,Fibronectin以及普通培养板(TCP)上进行成骨诱导,7d后利用RT-PCR检测成骨相关基因RUNX2和OCN的表达,成骨诱导21天后,茜素红染色等方法检测四组成骨差异。2.研究P2X7受体与h PDLSCs成骨分化的关系。分离培养h PDLSCs,分为4组,α-MEM组细胞用α-MEM普通培养基培养,成骨诱导液组细胞用成骨诱导液培养,激动剂组用100 nmol/L三磷酸腺苷+成骨诱导液培养,拮抗剂组用100nmol/L KN-62+成骨诱导液培养,于成骨诱导7d时,RT-PCR检测成骨相关基因OCN和Runx2的m RNA表达,同时用RT-PCR以及Western blot检测P2X7受体在基因和蛋白水平的表达;在成骨诱导21d后利用茜素红染色检测成骨效果。3.P2X7受体在ECM促进h PDLSCs成骨分化中的作用。体外实验:将h PDLSCs分别接种在h BMCs-ECM与普通培养板(TCP)上,成骨诱导液诱导7d后,免疫荧光观察P2X7受体的表达;细胞接种到ECM和TCP表面,并在ECM表面增加一组抑制剂KN-62组,在TCP表面增加一组激动剂ATP组,成骨诱导7d后进行Western blot检测P2X7受体表达,采用Real-time PCR检测OCN、Runx2的表达;诱导21天后茜素红染色观察成骨结果;体内实验:将h PDLSCs分别接种于TCP和ECM上制备细胞膜片,包裹40mg羟基磷灰石HA颗粒,移植于裸鼠背部皮下,于SPF级环境饲养。60天后,处死裸鼠,取出移植物,固定液固定。10%EDTA溶液脱钙10天,脱水、包埋、切片并染色,观察两组新骨形成差异。研究结果:1.通过有限稀释法获得的h PDLSCs,表面标记物符合间充质干细胞的特性,具有克隆形成能力和多向分化潜能。分离培养的细胞在四组中生长状况良好,其中h BMCs-ECM组和h PDLCs-ECM组在成骨诱导后,成骨相关基因表达显著高于其余两组,其中h BMCs-ECM组成骨效果高于h PDLCs-ECM组,有统计学差异。2.外源性三磷酸腺苷可在h PDLSCs成骨诱导过程中明显促进h PDLSCs的成骨分化。三磷酸腺苷可以激活h PDLSCs中P2X7受体表达,且P2X7受体的表达与h PDLSCs的成骨效果正相关。3.体外实验中,细胞生长在h BMCs-ECM表面诱导7d后,P2X7受体表达显著高于TCP表面;Western blot结果显示h BMCs-ECM表面P2X7受体表达显著高于TCP组,而在ECM表面加入拮抗剂后显著降低了P2X7表达,在TCP表面添加了激动剂后提高了P2X7表达;成骨诱导21天后茜素红染色结果显示,h BMCs-ECM组钙化结节显著高于TCP组,ECM表面加入拮抗剂后显著降低了矿化形成,而TCP表面加入激动剂后显著提高了矿化形成能力;体内实验,HE染色镜下观察,在h BMCs-ECM表面形成的牙周膜干细胞膜片在体内新生骨量明显多于在TCP表面。研究结论:1.组织特异性ECM能有效促进了h PDLSCs成骨分化的潜能,其中h BMCs-ECM的效果好于h PDLCs-ECM。2.P2X7受体与h PDLSCs成骨分化的过程密切相关。3.P2X7受体在组织特异性ECM促进h PDLSCs成骨分化中,发挥着重要作用。