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嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor,CAR)细胞免疫治疗在肿瘤领域已经取得突破性的进展。大部分非霍奇金淋巴瘤((non-Hodgkin’s lymphoma,NHL)与CD20的异常表达有关,CD20也成为治疗非霍奇金淋巴瘤的一个重要的靶点。为探索以CD20为靶点的恶性B细胞淋巴瘤有效的治疗方法,以及研究与开发靶向CD20阳性恶性B细胞淋巴瘤的细胞治疗药物。针对CD20抗原的人鼠嵌合的单克隆抗体利妥昔(Rituximab),对其鼠源的单链可变区(single--chain fragment variable,scFv)部分进行人源化改造,以降低免疫原性。构建以CD20为靶点人源化和野生型的scFv为胞外段的三代CAR修饰的NK-92细胞,多种体外实验验证两种CAR修饰的NK-92细胞的抗肿瘤活性。本研究进行以下的实验1.在Rituximab基础上,利用重叠PCR(Overlapping PCR)方法构建野生型anti-CD20的pCMV-scfv-Fc及人源化改造Rituximab单链可变区的anti-CD20pCMV-H-scfv-Fc表达载体,瞬时转染后Western Blotting结果显示目的蛋白均有表达。2.亲和层析获得anti-CD20-scfv-Fc融合蛋白(scfv-Fc),流式细胞分析或ELISA方法表明scfv-Fc融合蛋白具有生物活性,此外,人源化anti-CD20-H-scfv-Fc融合蛋白(H-scfv-Fc)同样具有生物活性。3.采用重叠PCR方法构建CAR胞外段为野生型anti-CD20-scfv的pCDH-CARCD20(CARCD20)及人源化anti-CD20-scfv的pCDH-hCARCD20(hCARCD20)慢病毒载体。两者瞬时转染至293T细胞后收集慢病毒颗粒,稀释法以及流式检测慢病毒的滴度,测得CARCD20的滴度为3.56×10~8TU/mL、hCARCD20为1.785×10~8TU/mL,前者约为后者的两倍。4.以MOI=20感染NK-92细胞,流式细胞分析检测两者的感染效率均在97%以上;流式细胞分析表明,感染野生型CARCD20病毒的NK-92细胞(NK-92-CARCD20)的CAR表达量为59.5%、感染人源化hCARCD20病毒的NK-92细胞(NK-92-hCARCD20)的CAR为表达量35.2%。5.LDH释放检测的结果表明,在相同的效靶比条件下,Mock、NK-92-CARCD20和NK-92-hCARCD20对CD20~+Raji细胞的杀伤活性高于CD20低表达的K562-CD20细胞和阴性的K562细胞,效应细胞对靶细胞的杀伤效果与效靶比成正相关。当E:T=9:1时,NK-92-CARCD20和NK-92-hCARCD20对CD20~+Raji细胞的杀伤效果最佳,分别为64.36%(**P<0.01)、48.86%(**P<0.01)。在E:T=9:1时,TUNEL染色以及CFSE和PI共染结果也显示,NK-92-CARCD20和NK-92-hCARCD20对Raji细胞的杀伤效果没差异且均强于Mock。对三种效应细胞与Raji共培养后的凋亡标志物Cleaved caspase3、9、PARP检测,结果说明NK-92-CARCD20和NK-92-hCARCD20对Raji细胞的裂解效果强于Mock;与Mock相比,NK-92-CARCD20和NK-92-hCARCD20和Raji细胞共培养所释放的穿孔素和颗粒酶的量存在差异,暗示穿孔素和颗粒酶增强NK-92-CARCD20和NK-92-hCARCD20对靶细胞进行杀伤;效应细胞与三种CD20表达不同量的靶细胞共培养6、12、24h后,测得上清中IL-2、IFN-γ的量均无差异,从一定角度说明CAR修饰的NK-92的安全性。综上所述,本研究成功构建了野生型anti-CD20-scFv及人源化anti-CD20-scFv作为CAR胞外段修饰的NK-92细胞株,并验证了其具有良好的体外抗肿瘤活性;当两种在CAR表达量一致的时,其对CD20~+Raji细胞具有相近的杀伤能力,并具有一定的安全性,NK-92-hCARCD20细胞具有成为低免疫原性的靶向CD20~+细胞的药物的潜力。