低分子量肝素是一种广泛应用于临床治疗的抗凝血药物。Heparosan是一类天然酸性多糖,在E. coli K5里以荚膜多糖的形式合成,分子量为10-20kDa,是生产肝素和硫酸乙酰肝素的前体物质。通过生物途径法从heparosan出发制备heparin的研究至关重要。本课题以制备低分子量肝素为目的,表达纯化了肝素酶Ⅰ和肝素酶Ⅲ,并将两种酶分别应用于heparin和heparosan的解聚。为了能够定量E. coli K5发酵产物中的heparosan,建立了一种基于肝素酶Ⅲ解聚heparosan的检测样本中heparosan含量的酶学方法。同时为了提高E. coliK5的heparosan产量,应用Red同源重组技术敲除了合成E. coli K5脂多糖外核的关键基因waaR。用IPTG诱导携带HepA基因的工程菌成功表达了肝素酶Ⅰ,分子量为44.83kDa。通过低温培养以及分子伴侣的协助,获得部分可溶性蛋白。将可溶性蛋白经Ni-NTA亲和层析,纯化后的酶比活为10427.50U/mg,纯化了6.47倍。将肝素酶Ⅰ应用于heparin的解聚,发现解聚效果良好。同样诱导携带HepC基因的工程菌成功表达了肝素酶Ⅲ,分子量为73.07kDa,并对酶的生产条件进行了优化。将得到的粗酶同样过柱分离纯化,纯化后酶比活为5372U/mg,纯化了1.61倍。将肝素酶Ⅲ应用于heparosan的解聚,解聚效果良好。利用肝素酶Ⅲ特异性解聚heparosan的功能,建立了一种检测样本heparosan含量的酶学方法。该法反应温和,而且操作简捷,只需通过检测酶反应产物的吸光度,就可以从标准曲线公式中推算出待测液heparosan的浓度。以E.coli K5基因组为模板,利用PCR技术成功克隆了waaR基因。通过NCBI同源比对,发现其与E. coli strain F632waaR基因相似度为99%,有两个碱基不同。将pKD46导入E. coliK5,使宿主能够表达λRed重组酶。再设计含有两端各56bp同源臂的敲除引物,以pKD4为模板,PCR扩增得到含有卡纳霉素抗性基因的打靶DNA。将打靶DNA电转化入宿主细胞,LB培养基复苏,发现复苏过夜比仅复苏2h能够得到更多具备卡那霉素抗性的转化子。转化子经PCR测序验证,重组框架全长1607bp,两端同源臂完整存在,而剩余的waaR基因序列已经被筛选基因所替换。透射电镜比较野生株和突变株的荚膜形态,发现野生株表面存在一层毛绒状的物质,应为荚膜多糖层,而突变株表面较为光滑,未见荚膜。