醛酮还原酶(Aldo-Keto Reductase, AKR)是一个能够还原醛酮基化合物的蛋白质家族。许多AKR成员具有高度的氨基酸序列同源性和相似的空间结构,而且其酶促反应共享一些底物。虽然研究者发现AKR与许多生理过程相关,但由于缺乏专一和准确的定量分析,相关的研究难以深入。多反应监测(MRM)是近年来涌现出来的一种精确定量蛋白质组的质谱方法。在本研究中,我们建立了MRM技术绝对定量测定人源AKR家族成员的方法,同时将其应用于不同肿瘤细胞系中AKR含量的比较。基于AKR重组蛋白酶解肽段的质谱鉴定和MRM检测筛选结果,我们确定了若干MS/MS信号最强的特异肽段,作为AKR的MRM定量依据。为提高灵敏度,我们采用SDS-PAGE分离和富集AKR,并评估了这种富集AKR的方法所带来的实验误差,确证了其对定量分析并未产生较大的误差。为了建立绝对定量必需的标准曲线,且避免在多样本分析中标准曲线重复测定的繁琐操作,我们在AKR定量分析中引入了三标稳定同位素标记试剂mTRAQ。mTRAQ具有相同化学结构但含有三种不同的质量,利用三重四级杆质谱仪可将mTRAQ标记的肽段加以鉴别。我们将mTRAQ分别标记了标准曲线,内标及样本；发现mTRAQ标记法能够有效消除细胞类样品中内源性目标蛋白对标准曲线的影响,使得在多个细胞系混合而成的背景中测得的标准曲线,与单一细胞系的背景中测得的标准曲线结果较为一致。通过优化MRM实验及稳定同位素内标的校正,我们测定了6种AKR(AKR1A1, AKR1B1, AKR1B10, AKR1C1/C2, AKR1C3和AKR1C4)的绝对丰度,实验结果重复性较高。我们选择了7个不同来源的肿瘤细胞系,利用这种MRM绝对定量方法对细胞系中的AKR进行了系统性的定量分析。实验结果表明：1)在所有的AKR成员中,AKR1A1的丰度在所测定的7个肿瘤细胞系中相对稳定；2) AKR1C亚家族成员的丰度在这些肿瘤细胞中差别很大,然而这些AKR1C并未呈现相对规律的丰度分布；3)AKR1C4作为肝脏特异的AKR蛋白仅在Huh7细胞系中检测到。我们在三个AKR成员(AKR1A1, AKR1B1、AKR1B10)中各选了2条肽段,进一步比较了单肽段和双肽段之间的所获的绝对定量结果。我们发现,对于某些AKR而言,基于单肽段和双肽段的MRM绝对定量结果确存在一定差异,但是聚类分析提示,AKR在多个肿瘤细胞系中的丰度分布并不受肽段选择多少的影响。我们采用MRM方法观察到在过氧化氢处理条件下Huh7细胞中AKR1C1的肽段(LWCNSHRPELVRPALER)还原态的Cys87的信号强度明显受到氧化应力的影响而下降。而尚未有报道称AKR1C对氧化应力敏感；为了深入探讨了AKR1C1的半胱氨酸修饰与其活性的关系,我们利用IAA修饰重组AKR1C1,观察到随着修饰剂孵育时间的延长,AKR1C1的催化活性逐渐下降；用IAA/NEM两种修饰剂在AKR1C1变性前后分别标记其半胱氨酸,并用质谱分析了变性前被修饰的半胱氨酸位点,鉴定到Cys87是个较活泼的半胱氨酸；通过检测定点突变得到的重组蛋白质AKR1C1-C87S,表明了其并不受IAA的修饰影响。由此,我们首次发现了AKR1C亚家族中也存在活泼巯基的蛋白质,AKR1C1的还原态C87对于它的解毒功能可能至关重要的。