高胆固醇血症是一种以血清胆固醇水平升高为主要特征的脂类代谢异常疾病，属于Ⅱα型高脂蛋白血症。其主要表现为血清胆固醇水平的升高，导致胆固醇在血管聚集，形成动脉粥样硬化，大量的临床及流行病学研究已经证明脂质代谢异常与冠心病的发生、发展密切相关。而且已经证实血清总胆固醇水平升高是冠心病发病的主要危险因素，也是冠心病患者冠状动脉事件增加的重要危险因素。　　 本课题的第一部分应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术，观察不同程度高胆固醇血症患者LDL-R基因XspⅠ、ClaⅠ和HinfⅠ多态位点的分布，揭示LDL-R基因的多态性与高胆固醇血症之间的相互关系。　　 人类CETP能介导血浆胆固醇酯和甘油三酯在高密度脂蛋白（HDL-c）和含载脂蛋白B的脂蛋白，如LDL-c和极低密度脂蛋白（VLDL-c）之间的交换，通过这种交换，CETP能调节血浆HDL-c的浓度、组成和颗粒的大小，在胆固醇逆向转运即胆固醇从外周组织流出运输至肝脏的过程中起着关键的作用，所以CETP是血浆HDL-c和LDL-c水平高低的主要决定因素之一，也是动脉粥样硬化的易感基因之一。已发现CETP基因的许多位点存在基因多态性，有研究认为CETP与HDL-c呈负相关，与LDL-c呈正相关，也有研究则认为CETP与HDL-c、LDL-c的关系不能确定，还有研究发现CETP与HDL-c无关，而与TC或LDL-c关系密切。CETP在高胆固醇血症发生发展过程中的作用机制尚不清楚，本课题的第二部分试图揭示CETP基因ToqⅠB多态性、D442G突变与高胆固醇血症之间的相互关系。　　 近年来研究发现PCSK9是引起高胆固醇血症的第三个原因，它的作用已经引起了人们的注意。PCSK9是编码前蛋白转化酶家族的一员，一些占优势的功能获得型突变与高胆固醇血症密切相关，甚至与非常严重的家族性高胆固醇血症（FH）样表型有关。正常情况下PCSK9的表达可以下调LDL-R的表达，间接引起LDL-R蛋白的降解，所以功能获得型突变引起血浆LDL-c的升高，而功能缺失型突变引起血浆LDL-c水平的下降。这就是本课题第三部分所关注的问题。　　 第一部分 LDL-R基因多态性分析与高胆固醇血症的相关性研究　　 目的：通过采用PCR-RFLP技术对高胆固醇血症人群LDL-R基因已知的XspⅠ、ClaⅠ和HinfⅠ多态位点进行研究，比较它在不同程度的高胆固醇血症患者及对照人群中的分布，揭示LDL-R基因的多态性与高胆固醇血症之间的相互关系。　　 方法：1568例胆固醇异常患者均来自该院体检中心查体者，按照2007年“中国成人血脂异常防治指南”中临床分型标准，分为两组：（1）高胆固醇血症组（HC组）994例；（2）边缘高胆固醇血症组（BHC组）574例。同时期健康体检者374例作为对照组（NC组），年龄、性别均匹配。血脂异常均为初次诊断，且未用任何降脂药物，所有研究对象经血、尿、便常规、心电图、B超等检查均未发现异常。且所有受试对象均除外甲状腺功能亢进症、甲状腺机能减退、慢性肝病、糖尿病、糖尿病肾病、肾病综合症、肾移植术后等影响脂类代谢的疾病，排除应用影响糖脂代谢药物者。受试者均测量身高和体重，计算体重指数（BMI），检测空腹血清TC、甘油三酯（TG）、HDL-c、LDL-c、VLDL-c水平；取4ml EDTA-K2抗凝血，提取基因组DNA，引物设计采用生物学软件Primer5.0，并与GenBank进行比对。采用PCR和RFLP方法扩增目的基因片段，进行多态性分析。所有统计学分析都在SPSS13.0软件包中完成。用基因计数法计算基因频率和基因型频率；各统计指标都以均数±标准差（mean±SD）表示；不同程度高胆固醇组和对照组间统计指标的比较采用t检验；不同程度高胆固醇组和对照组间基因型频率和等位基因频率的差异用x2检验；在不同基因型中各个临床参数比较采用方差分析，组与组之间采用单基因方差分析；并通过Logistic回归分析LDL-R基因和血清胆固醇水平升高的关系。P<0.05为具有统计学意义。　　 小结：　　 1.血浆TC、LDL、HDL水平与LDL-R基因XspⅠ、ClaⅠ、HinfⅠ酶切位点多态性密切相关。　　 2.LDL-R基因的第2、4外显子的XspⅠ、第8、12外显子的ClaⅠ、第10B、14外显子的HinfⅠ酶切位点多态性与高胆固醇血症密切相关。　　 3.LDL-R基因的第9外显子的HinfⅠ酶切位点多态性与高胆固醇血症未见独立相关关系。　　 第二部分 CETP基因TaqⅠ B多态性、D442G突变与高胆固醇血症的相关性研究　　 目的：应用PCR-RFLP对中国汉族人群CEIP TaqⅠ B多态性、D442G突变在对照组与不同程度高胆固醇血症组的等位基因频率和基因型频率进行了计算，同时测定两种多态不同基因型的血浆CETP浓度、血脂水平，分析CETP TaqⅠ B多态性、D442G突变对血浆胆固醇水平的影响，并探讨其相关关系。　　 方法：730例胆固醇异常患者均来自我院体检中心查体者，按照2007年“中国成人血脂异常防治指南”中临床分型标准，分为两组。其中包括：（1）高胆固醇血症组446例；（2）边缘高胆固醇血症组284例。同时收集正常健康体检者187例作为对照组。性别、年龄均匹配。检测方法及统计方法同第一部分。　　 小结：　　 1.高胆固醇血症组和边缘高胆固醇血症组血清CETP和LDL-c水平明显高于对照组，血清HDL-c水平明显低于对照组。　　 2.CETP基因TaqIB多态性与高胆固醇血症密切相关，B1等位基因携带者血清胆固醇水平明显高于B2等位基因携带者。　　 3.CETP基因D442G突变与高胆固醇血症有相关性，该突变是高胆固醇血症的主要危险因素之一。　　 第三部分高胆固醇血症患者PCSK9基因测序结果分析　　 目的：为了寻找PCSK9基因与高胆固醇血症发生发展相关的进一步证据，本部分采用直接测序的方法对100例高胆固醇血症患者的PCSK9基因12个外显子进行筛查，以期发现新的突变位点，揭示PCSK9基因的突变位点与高胆固醇血症发生之间的相互关系。　　 方法：100例高胆固醇血症患者均来自该院体检中心查体者。血脂水平符合2007年“中国成人血脂异常防治指南”中高胆固醇血症的诊断标准，同时收集正常体检者50人作为对照组，性别、年龄均匹配，血脂异常均为初次诊断，检测血清空腹TC、TG、HDL-c、LDL-c、VLDL-c水平；取4mlEDTA-K2抗凝血，提取基因组DNA，引物设计采用生物学软件Primer5.0，并与GenBank进行比对。采用PCR方法扩增目的基因片段，对PCR产物进行测序，测序结果用DNAMAN软件与GenBank公布的PCSK9基因序列进行比对，找出突变位点。　　 小结：　　 1.PCSK9基因错义突变D320N，V312F，R319E，框移突变934delGV312S，同义突变A305A、Q342Q、K125K，第2内含子5剪接位点突变与高胆固醇血症有关。　　 2.错义突变R93C与低胆固醇血症有关。　　 综合上述三部分内容，本研究得出如下结论：　　 1.PCR-RFLP可以准确的分析LDL-R和CEIP基因多态性，方法简便快捷，适合于大规模流行病学调查和临床实验室应用。　　 2.TC、LDL、HDL水平与LDL-R基因XspⅠ、ClaⅠ、HinfⅠ酶切位点多态性密切相关；LDL-R基因的第2、4外显子的XspⅠ、第8、12外显子的ClaⅠ、第10B、14外显子的HinfⅠ酶切位点多态性与高胆固醇血症密切相关；第9外显子的HinfⅠ酶切位点多态性与高胆固醇血症未见独立相关关系。　　 3.CETP基因TaqIB多态性与高胆固醇血症密切相关，B1等位基因携带者血清胆固醇水平明显高于B2等位基因携带者。D442G突变与高胆固醇血症有相关性，该突变是高胆固醇血症的主要危险因素之一。　　 4.PCSK9基因的错义突变D320N，V312F，R319E，框移突变934delGV312S，同义突变A305A、Q342Q、K125K，第2内含子5剪接位点突变与高胆固醇血症有关；错义突变R93C与低胆固醇血症有关。　　 5.本研究发现LDL-R基因XspⅠ、ClaⅠ、HinfⅠ酶切位点多态性；CETP基因TaqIB多态性、D442G突变；PCSK9基因D320N、V312F、R319E、934delGV312S、A305A、Q342Q、K125K和第2内含子5剪接位点突变与高胆固醇血症的发生有关，而PCSK9基因R93C突变与低胆固醇血症的发生有关。