焦虑症是一种较为常见的慢性精神障碍疾病,其特点是情绪低落、兴趣缺乏、负罪感,常伴有过度焦虑,出现不安、失眠、肌肉紧张等生理性觉醒症状。焦虑症的特点主要表现为患病率高、死亡率高和复发率高等,它严重影响人们的生产和生活质量,也给个人家庭和社会带来了巨大的经济负担。焦虑症的发病机制十分复杂,以往对其发病机制的研究在遗传、免疫和内分泌等方面较多,全基因组相关研究证实了焦虑症的遗传特性,但这种情况也可能由环境因素触发。尽管抗抑郁药在焦虑症治疗中有很好的疗效,如:选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRIs)等,但患者常出症状复发状或不良反应等缺点。北五味子(Schisandra chinensis(Turcz)Baill)作为我国传统的安神药,其主要药理活性是木脂素,木脂素具有多种药理作用,可清除体内自由基、保护肝脏、提高机体免疫力及中枢抑制与安神作用等。在临床上,多以其炮制品入药,经过炮制后,五味子的功效发生了很大变化,原因主要是五味子经黄酒炮制后所含有效成分发生了变化。目前国内外多是以生品五味子为对象展开研究,而关于酒制五味子的抗焦虑机制的研究报道甚少,此外,最新的研究发现肠道菌群与焦虑症的产生有着密切联系,肠道菌群能够对人体的代谢表型产生影响,对于维持人体的健康具有重要意义,其可能为焦虑症治疗的新靶点,因此本课题基于代谢组学和肠道菌群对酒制五味子的抗焦虑机制进行了深入探索。具体研究内容如下:1、基于UPLC-Q/TOF-MS技术对五味子炮制前后水提物部位12种木脂素定量分析。研究结果显示,酒制五味子水提物中6-邻苯甲酰基戈米辛O、五味子素、戈米辛D、五味子甲素、戈米辛T、五味子乙素、五味子丙素7种木脂素含量增加,五味子酯甲、五味子酯乙、五味子酯丙、五味子酯丁、新南五味子酸B5种木脂素含量降低。2、本课题采用国际公认的慢性不可预知应激(CUS)的方法诱导焦虑症大鼠模型,以旷野实验(OFT)、高架十字迷宫实验(EPM)、悬尾实验(TST)和强迫游泳实验(FST)作为评价指标,经过5周的刺激后,模型组大鼠在行为学上表现为旷野环境自主探索行为降低,高架十字迷宫闭合臂中停留时间增加、悬尾不动时间和游泳不动时间的延长,这表明CUS诱导的焦虑大鼠模型建立成功。3、基于UPLC/LTQ-Orbitrap-MS技术对焦虑大鼠和空白大鼠的血浆和脑组织样本进行了非靶向代谢组学研究。结果表明,OPLS-DA分析显示焦虑大鼠的血浆和脑组织样本均存在明显的分类趋势,结合单变量的统计分析方法分别筛选到了49个和23个与焦虑症相关的血浆和脑组织的差异代谢物。进一步对这些差异代谢物进行分析,发现焦虑大鼠主要伴有甘油磷脂代谢、胆酸代谢、鞘脂代谢等代谢性异常。4、采用16S rRNA高通量测序方法对焦虑大鼠和空白大鼠肠道菌群结构进行分析。焦虑大鼠肠道菌群的多样性和丰富度与对照组具有明显差异,两组主要优势菌门均为厚壁菌门和拟杆菌门。Beta多样性分析发现焦虑大鼠与空白大鼠的肠道菌群结构存在明显的差异,进一步研究表明这一肠道菌群结构失衡的主要特征是一些已经报道过为有益的菌如乳酸杆菌却在焦虑大鼠肠道中丰度显著增加。这些菌群变化可能与焦虑的发生和发展具有某种关联。5、利用CUS诱导的焦虑模型评价酒制五味子和生品五味子水提物的抗焦虑作用。研究结果显示,通过行为学实验发现生、酒制五味子能显著增加焦虑大鼠旷野实验中的自主探索行为,增加焦虑大鼠在高架十字迷宫开臂上的停留时间,明显减少焦虑大鼠在悬尾、强迫游泳中不动时间,这提示生、酒制五味子对大鼠焦虑行为均具有良好的改善作用,酒五味子优于生五味子。ELISA、RT-q PCR、Western blot和Immunofluorescence的实验结果揭示酒制五味子能显著降低焦虑大鼠血浆中乳酸的含量、肝脏中GPR81m RNA的表达以及海马TNF-α的表达,酒制五味子能提高焦虑大鼠海马中S1PR2的表达量,上调肝脏AC和PKA蛋白的表达。这提示酒制五味子可能是通过调节脂质代谢途径以及降低海马组织中的炎症因子来产生抗焦虑作用的。其次,基于UPLC/LTQ-Orbitrap-MS的技术对上述给予酒制五味子的大鼠血浆样本进行代谢组学分析,进一步探讨酒制五味子对焦虑症大鼠整体代谢谱的影响及其相关的作用机制。结果显示,焦虑组与生品五味子组大鼠、焦虑组与酒制五味子组大鼠的血浆代谢均存在明显不同,利用统计学分析方法,发现鉴定了38个与焦虑相关的血浆代谢物。其中,与焦虑组大鼠相比,生品五味子调控了29个内源性代谢物,酒制五味子调控了36个内源性代谢物,生品五味子和酒制五味子同时调控了25个内源性代谢物。综上所述,本课题利用基于UPLC-Q/TOF-MS技术定量分析了炮制前后五味子中12种木脂素含量,然后采用UPLC/LTQ-Orbitrap-MS技术筛选并分析了与焦虑症血浆和脑组织相关的内源性差异代谢物,从代谢角度,揭示了与焦虑症相关的可能机制;然后利用16S rRNA高通量测序技术研究了焦虑大鼠肠道菌群的结构特征,分析得到了与焦虑相关的微生物种类;进一步研究了焦虑大鼠肠道菌群的结构改变是怎样对其代谢表型产生影响的,从而揭示了肠道菌群参与焦虑症发病可能的生理机制,对今后焦虑症患者的及时诊断和有效治疗具有十分重要意义。另外,我们通过分子生物学及代谢组学的方法探索生、酒制五味子治疗焦虑症的可能有效途径,以期为寻找安全有效的天然抗焦虑药物提供了中医药思路。