背景和目的:利用肠道黏膜免疫系统特点(包括:分泌性免疫为主、口服正常菌群微生物耐受、黏膜记忆应答弱和肠道内正常菌群可向肠黏膜下移位等)和大肠杆菌内移位性质,将含有真核表达质粒且具有破吞噬泡能力的菌壁营养缺陷型大肠杆菌工程菌株补充入肠道,将真核表达质粒传递给肠黏膜下细胞,使这些真核细胞分泌表达目的蛋白产生生物学效应。方法和结果:第一部分:以非病理性大肠杆菌工程菌DH10B为基础,利用pKD46介导的重组系统和kan/kil两次筛选系统,敲除其菌壁肽聚糖层重要成分(DAP)合成关键酶(ASD)基因,获得无抗抗生素基因标记的菌壁营养缺陷型大肠杆菌菌株E.coli DH10BΔasd,并对所得菌株进行性质检测,表型特征为菌壁营养缺陷型,革兰氏阴性杆菌,生化反应为典型大肠杆菌代谢特征;抗性特征为具有原菌株链霉素抗性;对数生长期增值速度为21.1分钟/代;在37℃条件下普通LB培养基中的半数裂解速度约为24小时等。第二部分:构建真核表达质粒(pdv_nirb_hly_cmv_gene),该质粒承载有nirb启动子(原核低氧启动子)控制的hly基因表达盒,并进一步将人促红细胞生成素(epo)基因和增强绿色荧光蛋白(egfp)基因分别构建入该质粒cmv启动子之下,获得真核表达质粒(pdv_nirb_hly_cmv_epo和pdv_nirb_hly_cmv_egfp),并对所得质粒进行鉴定,包括目的dna测序,质粒限制性内切酶酶切图谱分析,证实质粒构建正确;通过菌体还原型sds-page、菌体westernblot、挖膜n-末端氨基酸序列实验测定证实llo蛋白表达正确;通过转染质粒pdv_nirb_hly_cmv_epo的细胞培养液的免疫斑点、还原型sds-page、挖膜n-末端氨基酸序列实验测定证实epo蛋白表达正确;通过荧光显微镜观察转染pdv_nirb_hly_cmv_egfp质粒细胞,证实绿色荧光蛋白(egfp)表达等。第三部分:将获得的上述质粒电转入e.colidh10bΔasd,筛选获得重组菌株e.colidh10bΔasd(pdv_nirb_hly_cmv_epo)和重组菌株e.colidh10bΔasd(pdv_nirb_hly_cmv_egfp)。检测重组菌株e.colidh10bΔasd(pdv_nirb_hly_cmv_epo)表型特征为菌壁营养缺陷型,革兰氏阴性杆菌,生化反应为典型大肠杆菌代谢特征;抗性特征为具有链霉素抗性和卡那霉素抗性;对数生长期增值速度为29.6分钟/代;在37℃条件下普通lb培养基中的半数裂解速度约为24小时等。观察balb/c小鼠对菌株灌胃后的反应,确定安全灌胃剂量,证实灌胃剂量小于2×109cfu/只为安全剂量。重组菌株e.colidh10bΔasd(pdv_nirb_hly_cmv_egfp)体外被小鼠腹腔吞噬细胞吞噬过程观察,显示小鼠腹腔吞噬细胞可主动吞噬该细胞株并在荧光显微镜下观察到表达egfp细胞存在。激光扫描共聚焦荧光显微镜结果证实菌体可被吞入或侵袭入细胞。重组菌株e.colidh10bΔasd(pdv_nirb_hly_cmv_egfp)体外转染细胞(caco-2细胞、hela细胞、nih/3t3细胞、ana-1细胞、小鼠腹腔吞噬细胞)荧光显微镜下可以观察到表达egfp细胞存在。这些结果证实该重组菌株可将所含有的质粒传递给被侵袭的细胞。流式细胞仪的检测结果显示,被转染后表达egfp细胞比例分别为0.5%、0.2%、0.2%、0.1%和0.2%,与细胞计数法测量结果一致。分别取使用重组菌株e.colidh10bΔasd(pdv_nirb_hly_cmv_epo)和重组菌株e.colidh10bΔasd(pdv_nirb_hly_cmv_egfp)灌胃后balb/c小鼠肠道组织进行组织切片和免疫组化实验(抗llo抗体),证实灌胃重组菌株e.colidh10bΔasd(pdv_nirb_hly_cmv_epo)的balb/c小鼠肠道组织部分细胞基质内有llo蛋白存在,并且肠黏膜结构完整,细胞结构清晰,说明该重组菌菌体蛋白llo被释放入细胞基质;灌胃重组菌株e.colidh10bΔasd(pdv_nirb_hly_cmv_egfp)的balb/c小鼠肠道组织细胞内观察到egfp的表达,说明重组菌在细胞基质内释放了所含真核表达质粒pdv_nirb_hly_cmv_egfp,并且所载的egfp基因进行了表达。以上实验证实重组菌株e.colidh10bΔasd(pdv_nirb_hly_cmv_gene)作为基因递送系统,具有向细胞基质释放内容物的能力。用重组菌株e.colidh10bΔasd(pdv_nirb_hly_cmv_epo)灌胃balb/c小鼠,检测小鼠网织红细胞比例变化,实验组与空对照组比较,经t检验统计分析,p<0.05,数据组间差别显著,实验组的平均值为空对照组平均值的2.13倍。间隔21天后的再次灌胃后,实验组与空对照组比较,经t检验统计分析,p<0.05,仍然差别显著,实验组的平均值为空对照组平均值的约1.53倍。以上实验证实递送epo基因表达了epo蛋白,所表达epo蛋白发挥了生理作用。组织活菌培养检测重组菌株e.colidh10bΔasd(pdv_nirb_hly_cmv_epo)在balb/c小鼠体内的分布,显示在最初的1小时内肝脏中可检测到活菌,肠系膜淋巴结(含部分肠系膜)可在检测时间点检测到活菌,在其他位置未能检测到活菌。用rtq-pcr法检测重组菌株e.colidh10bΔasd(pdv_nirb_hly_cmv_epo)所携带的质粒,结果显示质粒向小鼠其他位置分布。以上两实验证实灌胃重组菌株后,在吞噬细胞携带重组菌株通过门静脉和肠道淋巴两条途径,向小鼠全身分布。多器官免疫组化实验检测质粒pdv_nirb_hly_cmv_egfp表达位置,证实pdv_nirb_hly_cmv_egfp主要在肝脏和脾脏内表达,其他器官偶有表达。结论:综上所述,本研究用同源重组技术和kan/kil反筛选系统获得无引入筛选抗性基因的细菌壁营养缺陷型菌株e.colidh10bΔasd;构建真核表达质粒pDV_nirb_hly_cmv_gene;筛选后获得重组菌株E.coli DH10BΔasd(pDV_nirb_hly_cmv_gene),经本研究证实该重组菌可将所载目的基因传递给机体细胞,并生成治疗用活性蛋白,达到一定的生物效应;同时也证实了通过灌胃含质粒活菌制剂,经肠道黏膜进行基因治疗方案可行,如对载体菌进行进一步的改造,将具有较好的应用前景。与传统基因治疗向机体注射载体不同,本研究是向机体胃肠道内补充含质粒活菌制剂,利用自然界原有的细菌移位途径,将目的基因传递给机体细胞,产生生物效应。本系统的优点为避免注射,同时还可以降低生产成本,方便储存运输。目前本研究的局限性为,目的基因表达量仍然有待进一步提高。此外,提出一个肠道黏膜免疫屏障强度自动控制假说,即在肠道黏膜免疫屏障完整的情况下,PP结可看作“肠道内生物威胁强度的感受器”,以与肠道内微生物等“接触”的方式进行评估,激发效应链,维持肠道黏膜屏障强度,削弱来自肠道内生物威胁强度,将来自肠道内的生物威胁强度限制在可控范围内,借以适应环境变化,特别是肠道微环境的变化。