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谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase,GAD;EC 4.1.1.15）是一种依赖于PLP（pyridoxal-5-phosphate,PLP）的II类氨基酸脱羧酶,可专一性催化L-谷氨酸脱羧生成γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）,在食品、医药和化工领域具有重要的应用价值。GAD的热稳定性较差,严重影响了其在工业上的应用,提高其热稳定性对于GAD的研究与应用都具有重要意义。本论文以来源于短乳杆菌Lb.brevis CGMCC 1306的谷氨酸脱羧酶（GAD1407）为研究对象,利用计算机辅助分子设计方法,识别了对酶热稳定性具有重要影响的关键氨基酸残基,并以此为基础设计了引入同源嗜热酶的共有残基和引入二硫键等2种酶分子改造方案,通过定点突变和突变酶性质测定,最终获得了热稳定性得到显著提高的突变酶。主要研究结果如下:1.通过数据挖掘,在Brenda酶数据库中搜索到了5种GAD1407的同源嗜热酶,通过序列比对找出了10个氨基酸残基位点上属于嗜热酶特有的氨基酸残基,然后利用Fold X软件计算了在GAD1407中引入这10个氨基酸残基对酶解折叠自由能的影响,确定了可以显著降低酶分子折叠自由能的5种氨基酸残基改造方案,通过定点突变构建了A35P、I105M、N193D、D203E、S325A等5个突变酶并测定了它们的酶学性质。结果发现:突变酶D203E和S325A的热稳定性高于野生型,其T5015值分别为62.6°C和61.7°C,分别较野生型(T5015=60.3°C)提高了2.3°C和1.4°C,且S325A的kcat/Km值比野生型提高了61.9%。而突变酶N193D的热稳定性虽有所下降,但其kcat/Km值为4.00 s-1·m M-1,比野生型提高了55.6%。基于以上结果,对这3种突变方式进行了双组合突变,结果发现,突变酶N193D-D203E、N193D-S325A的T5015分别为63.2°C和62.1°C,但与单突变酶D203E、S325A的半失活温度相差不大（差距均在1℃以内）,且两种突变酶的kcat/Km分别为2.04 s-1·m M-1和2.64 s-1·m M-1,催化效率与各单突变酶相比反而下降,可能由于双突变的引入使得酶的结构发生了较大的变化,酶的催化性质也随之发生改变。2.运用二硫键设计程序Db D对GAD1407进行分析,找到了适合引入二硫键的位点,在此基础上采用B-factor分析和能量计算的方法对这些位点进行了评估,筛选出了4组有助于提高酶结构刚性的突变方案:184C-414C、191C-219C、369C-379C、370C-379C,然后通过定点突变构建了突变酶,对这些突变酶热稳定性和催化活性的研究发现:突变酶191C-291C和369C-379C的T5015分别比野生型(T5015=60.3°C)提高了3.0°C和4.3°C,而且突变酶369C-379C的最适催化温度提高到了56°C;突变酶191C-291C和369C-379C的kcat/Km分别为1.01s-1·m M-1和2.25 s-1·m M-1,分别为野生型的39%和88%。表明这两种突变都提高了酶的热稳定性,但191C-291C突变对酶的催化活力有严重的负面影响,而369C-379C突变对酶的催化活力无显著影响。3.为更深入的了解各突变酶热稳定性发生改变的分子机制,构建了这些突变酶的三维结构模型,利用Gromacs软件对野生酶和突变酶进行了时长为30 ns的分子动力学模拟分析。结果发现,突变体D203E、S325A、191C-219C、369C-379C在整个模拟过程的平均RMSD（均方根偏差,root mean square deviation）值均低于野生型,表明这4种突变酶具有更高的结构刚性,与它们热稳定性提高的实测数据吻合。此外,根据PIC在线服务器考察了氨基酸残基突变对酶分子内部作用力环境的影响,结果发现,S325A和369C-379C突变导致分子内形成了新的疏水键和二硫键,这可能是它们提高酶分子结构刚性和热稳定性的分子机理。