本课题研究包含了三个分子克隆系统改建的技术性课题,两个黑色素瘤基因治疗的课题和一个黑色素瘤全基因组耐药基因筛查的课题,这三个课题同时也是三个技术课题成果的应用和进一步证明。此外还在课题组原有的黑色素母细胞可逆性永生化的研究基础上进行了SV40-T抗原对黑色素母细胞永生化重编程的研究。各个部分课题相对独立完整又相互关联。Daniel Gibson开发的Gibson DNA Assembly是一种基于双链DNA分子同源序列进行无缝拼接的DNA连接方式,相较于传统的基于内切酶位点的分子克隆连接方式有其独特的优势。本研究基于DNA Gibson Assembly法,突破以往分子克隆的多种局限性,进行了三种分子克隆技术的革新：一、发明了无需重组的腺病毒构建系统；二、创建了多段干扰序列一步合成共表达的siRNA表达系统；三、建成了低成本,全基因组覆盖,简便易行,随机无偏性的siRNA文库。本课题组在黑色素细胞的干细胞生物学,肿瘤生物学方面有多年的研究积累。技术的开发是为了应用,上述分子克隆表达系统构建完成后,我们将这些技术探索性地用于黑色素瘤基因治疗和耐药靶点筛查的研究,一方面在科研实践中验证所革新技术的功能,另一方面借助新的工具在黑色素瘤治疗,黑色素瘤耐药领域做一些分子机制研究,希望能为黑色素瘤基因治疗,抗耐药基因筛查的科研与临床实践提供新的方法和理论依据。此外,基于实验室的黑素母细胞可逆性永生化研究基础,从新发现的黑素母细胞永生化细胞株在体生成畸胎瘤样组织块现象出发,围绕SV40-T抗原对黑素母细胞的重编程现象和机制展开研究,一方面进一步明确SV40-T抗原黑素母细胞永生化细胞系的的可行性,安全性及其他可能的潜能。另一方面为传统的SV40-T抗原永生化细胞技术补充理论依据。主要结果和结论如下：1.构建了无穿梭质粒腺病毒过表达载体pROS和pGOS,以pROS为载体,以GFP为目的基因进行Gibson Assembly连接,成功绕开穿梭质粒和重组的步骤,直接将目的基因连接到完整的腺病毒骨架上。此法获得阳性克隆的效率大于70%,构建的腺病毒质粒能顺利包装成腺病毒并进行扩增,病毒感染细胞后能高效率表达绿色荧光。这种无穿梭质粒腺病毒构建方法效率高,流程简单,成本低,避免了重组步骤中突变的高风险,对目的基因选择范围大,是一种优越的腺病毒包装新技术。2.构建了多段序列siRNA一步合成逆转录病毒骨架(pSOK),腺病毒骨架(pAdTrace-OK, pAdTrack-OK)和Piggy-bac质粒骨架(pBOK)。设计构建了含有H1,U6背靠背序列的pB2B质粒用于多段序列siRNA嵌入序列的制备。用pSOK为代表,以b eta-cat enin干扰做测试,发现该方法能够短时间,低成本,高效率获得多个干扰片段同时连接到同一载体的克隆,在多个人和小鼠细胞系的体内体外实验中证实该法合成的多序列siRNA表达系统能高效率发挥沉默目的基因的功能。是一种优良的基因沉默新方法。3.以逆转录病毒骨架pSOK为载体,化学合成法随机合成的19个碱基siRNA片段为嵌入序列,用Gibson DNA Assembly方法进行连接,构建出全基因组覆盖的siRNA逆转录病毒随机文库。经菌落PCR,克隆计数,测序,感染后细胞异质性克隆生成观察等方法鉴定,该文库一次合成克隆数达到2-3×106,且具有随机性和异质性,单次使用能够完全覆盖哺乳动物功能基因表达谱,且操作过程简单,省时经济,在感染小鼠黑素母细胞系imc23的测试中表现出较高的感染效率和明确的使细胞生成异质性克隆的功能。是一种优良的siRNA文库构建技术,科研和临床应用前景广阔。4.使用无穿梭质粒腺病毒载体构建的分泌型IGF-1R结构抑制蛋白表达腺病毒AdRdnIGF-1Rα和AdRdnIGF-1Rβ可以明显抑制人和小鼠黑色素瘤的生长,其中AdRdnIGF-1Rβ的效果更明显。抑制肿瘤生长的主要原因是促进了黑素瘤细胞的凋亡,也与一定程度上抑制了细胞进入分裂期有关。提示我们构建的分泌型IGF-1R结构抑制蛋白可以作为黑色素瘤基因治疗的新的手段,有效抑制黑色素瘤的生长。同时也实践证明了我们所构建的无穿梭质粒腺病毒构建系统效率高,易操作,表达目的基因的能力强而稳定。5.以之前构建的多片段siRNA表达载体pAdTrace-OK为载体,构建3个序列IGF-1R干扰腺病毒AdRhIGF1R-OK(人)和AdRmIGF1R-OK(小鼠)。以人黑色素瘤细胞系A375,小鼠黑色素瘤细胞系B16F10为细胞模型,在细胞水平和动物在体水平证明了我们构建的多片段siRNA表达载体能高效简便地构建3个序列IGF-1R干扰腺病毒。导入细胞后沉默IGF-1R的效果明显。IGF-1R多片段siRNA序列干扰腺病毒在细胞与动物水平均能有效抑制黑色素瘤的生长。抑制肿瘤生长的主要原因是促进了黑素瘤细胞的凋亡。可以作为黑色素瘤基因治疗的新的手段。6.我们以人黑色素瘤A375为细胞模型,导入构建的全基因组siRNA文库后针对目前国际一线用抗黑色素瘤药物建立耐药细胞克隆。再根据耐药克隆中可追踪的siRNA片段追踪相对应的抗耐药基因。目前我们已经成功获得了抗维罗非尼(vemurafenib)的耐药A375细胞,其耐药能力稳定而强大,能在维罗非尼水相饱和浓度(100uM)的情况下健康存活,而没有导入siRNA文库的对照组A375细胞在(25uM)时就没有细胞存活下来。目前的结果说明我们构建siRNA文库合成和使用方便,覆盖率高,随机性好,导入细胞后能强效发挥基因沉默的功能,使宿主细胞产生明显的差异表型。现在已经拿到的耐药人黑色素瘤细胞克隆是本实验的限速步骤,这一步的完成一方面证明了我们的实验方案的可行性,另一方面是后续的实验顺理成章做下去的关键基础。有望为维罗非尼的临床耐药的机制研究提供新的线索,为新药改良,补充治疗寻找新的靶点。7.证明了SV40-T永生化的黑素母细胞imcx相较原代黑素母细胞发生了重编程,在发育阶段上更为原始,分化潜能增加,而这一变化与SV40-T相关。imcx细胞中ips四个因子除Sox2以外均升高,多种多项潜能相关基因,神经脊特异性基因的表达升高,成球能力增强等均提示SV40-T的导入使原代黑素母细胞发生了去分化,变成了发育阶段上更早期的细胞。黑素谱系分化相关指标与预期不同,不降反升,可能与重编程后imcx仍能保持强大的向黑色素谱系终末分化的潜能相关。Sox2在SV40-T介导的黑素母细胞重编程中不是必须的,甚至可能是不被允许高表达的。imcx相较原代黑素母细胞分化潜能增加,具有两个胚层以上,至少4种细胞分化方向的潜能。imcx高表达三个胚层的一些分子标记,在二维培养和动物在体移植水平证明了imcx具有向黑色素细胞,神经元,神经胶质细胞,骨组织,脂肪组织的进行终末分化的潜能,在体移植生成的组织块呈畸胎瘤样组织学特点。用E2f荧光报告系统,p53荧光报告系统,imcx细胞水平和动物在体水平逐个过表mcx相较原代黑素母细胞分化潜能增加,具有两个胚层以上,至少4种细胞分化方向的潜能。imcx高表达三个胚层的一些分子标记,在二维培养和动物在体移植水平证明了imcx具有向黑色素细胞,神经元,神经胶质细胞,骨组织,脂肪组织的进行终末分化的潜能,在体移植生成的组织块呈畸胎瘤样组织学特点。过表达达ips 4个因子观察其分化程度和成畸胎瘤能力变化等实验手段对SV40-T重编程小鼠黑素母细胞的机制进行了初步探索。E2f的升高,p53的降低可能与SV40-T重编程小鼠黑素母细胞相关。在imcx中各个加入ips四个因子,均会导致细胞水平产黑素量增多,细胞倾向于分化。尤其是Oct4较为明显。在体移植时,加入不同ips因子的imcx成畸胎瘤的情况出现明显差异。提示C-Myc与SV40-T有协同作用,而Sox2作用相反。综上所述,本课题研究对腺病毒构建,基因干扰技术,siRNA文库技术做出了革新式的改进；为黑素瘤的基因治疗,耐药机制研究找到了新的方法和理论依据；发现了并证实了SV40-T对黑素母细胞永生化过程中产生的重编程作用,丰富了SV40-T永生化细胞建立细胞系的理论体系。