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双歧杆菌作为人体肠道内的固有菌群,与人体健康密切相关;同时作为重要的益生菌补充剂,具有巨大的市场潜力。双歧杆菌在肠道内分布呈现物种多样性,且菌种亲缘关系近;基于免疫学、核酸杂交及PCR检测技术无法实现复杂样品中双歧杆菌的高通量检测,而16S rRNA宏基因组测序不能在种水平有效区分双歧杆菌。因此,如何实现粪便等复杂样品中双歧杆菌在种及亚种水平的高通量检测,对建立双歧杆菌与人体健康和疾病的相互关系,实现双歧杆菌的靶向及精准干预具有重要意义。基于双歧杆菌的结构组成分析,针对复杂样品中低丰度双歧杆菌菌种的分离仍然缺乏有效方法。本研究旨在建立双歧杆菌在种及亚种水平的高通量、精准检测方法,并实现双歧杆菌种水平的高效、特异性分离,本研究主要结果如下:(1)基于双歧杆菌核心基因groEL基因,利用MiSeq测序技术,建立了针对复杂样品中双歧杆菌种及亚种水平的高通量检测方法。以双歧杆菌基因组信息为基础,通过CD-HIT软件,得到双歧杆菌核心基因群,即所有双歧杆菌共有基因;进一步通过进化速率分析发现,核心基因groEL具有在种水平鉴定双歧杆菌的潜力。利用MEGA软件构建120条双歧杆菌菌株groEL基因序列的系统发育树,结果显示,基于groEL基因可以实现双歧杆菌在种及亚种水平的进化分析。因此,本研究针对groEL基因的高度可变区及其两端保守区,设计检测引物对Bif-groEL-F,5’-TCC GAT TAC GAY CGY GAG AAG CT-3’和Bif-groEL-R,5’-CSG CYT CGG TSG TCA GGA ACA G-3’,利用MiSeq测序技术,测定样品中所有双歧杆菌的groEL序列信息,并结合groEL基因数据库和生物信息学分析,确定样品中双歧杆菌在种及亚种水平的结构组成。该方法可同时分析300个以上样本的双歧杆菌种水平的结构组成,实现双歧杆菌的高通量检测。该方法在双歧杆菌菌种检测中具有较高的准确度和特异性,当双歧杆菌含量从10~4 CFU到10~7 CFU时存在良好的线性关系,线性关系为y=0.9943x-2.048(R~2=0.978),检测限可以达到10~4 CFU。(2)基于MiSeq测序技术的双歧杆菌种水平高通量检测方法的应用研究。市售双歧杆菌益生菌产品的质量检测及粪便样品双歧杆菌种水平的结构组成分析研究。通过对14种益生菌产品检测发现,7种产品添加的双歧杆菌种类与标签上标明的双歧杆菌一致,但7款含量不一致,这7款含量不一致的产品存在添加乳双歧杆菌造假的嫌疑,上述结果说明,基于MiSeq测序技术的双歧杆菌种水平高通量检测方法可以应用于双歧杆菌产品的质量检测,这是对国标GB 4789.34-2012的有效补充。在双歧杆菌含量不一致的益生菌产品中,乳双歧杆菌的含量占绝对优势,其它双歧杆菌含量相对较低或未检出。本研究进一步探讨了该方法对不同来源粪便中双歧杆菌检测的有效性。结果显示,该方法可以在种水平实现对人和大鼠粪便样品中双歧杆菌的结构组成分析,基于qPCR的菌种特异性定量检测发现,该高通量检测方法可以准确定量粪便样品中双歧杆菌的含量。上述结果说明,本研究建立的双歧杆菌检测技术为分析肠道中双歧杆菌种水平的结构组成,提供了一种高通量、低成本的分析方法,解决了大样本分析双歧杆菌与人体健康关系的技术颈瓶。(3)利用SELEX技术筛选针对双歧杆菌菌种的高亲和性和高特异性适配体。通过构建随机寡核苷酸文库,以短双歧杆菌、两歧双歧杆菌为靶标,利用whole-bacteria SELEX技术,分别筛选得到针对短双歧杆菌的适配体BB16P以及两歧双歧杆菌的适配体CCFM641-5。基于核酸序列分析和二级结构预测,进一步对适配体BB16P和CCFM641-5进行序列优化,得到一条29 bp的短双歧杆菌适配体BB16-11f,适配体BB16-11f与短双歧杆菌结合的解离常数K_d为18.90±2.27 nM,对两歧双歧杆菌适配体CCFM641-5的优化表明,两端引物序列对适配体CCFM641-5的构象不可或缺。利用胰蛋白酶和蛋白酶K分别处理双歧杆菌菌体,结果发现,蛋白酶处理后的双歧杆菌菌体与靶标结合率明显降低,由此推测,适配体与双歧杆菌菌体结合的物质基础是菌体表面蛋白。本研究进一步利用ELAA(酶联适配体测定)方法,建立一种分别针对短双歧杆菌、两歧双歧杆菌的适配体/靶标/适配体三明治复合结构的可视化检测方法。针对短双歧杆菌,线性关系为y=0.0588x+0.3423(R~2=0.984),检测范围为10~3~10~7 cfu/mL,检测限可以达到10~3 cfu/mL。针对两歧双歧杆菌,线性关系为y=0.07663x+0.1471(R~2=0.983),检测范围为10~4~10~7 cfu/mL,检测限为10~4 cfu/mL。(4)偶联核酸适配体的靶向识别和磁珠的定向分离技术,建立了双歧杆菌菌种的高效、特异性分离方法。以短双歧杆菌、两歧双歧杆菌高亲和性和强特异性适配体为富集元件,结合链霉素标记的磁珠,初步建立一种双歧杆菌菌种的高效分离方法,结果显示,该分离方法可在一定程度上提高短双歧杆菌、两歧双歧杆菌的分离效率。