ReaL-time PCR及SSR技术在齿瓣石斛药材鉴别中的应用

来源 :南京师范大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xm10282008
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中国分布的兰科树兰亚科石斛属植物绝大多数可被用作加工中药石斛。由齿瓣石斛(Dendrobium devonianum Paxt.)加工而成的“紫皮枫斗”,作为中药枫斗类石斛产品的一种,在现今中国保健品市场中销量极大。由于需求的增长和野生资源的减少,如今枫斗市场上紫皮枫斗面临以次充好、仿冒掺假的威胁。  由于不同种石斛的形态学特征极为相似,仅使用形态学特征对非花期的齿瓣石斛及其相似种进行鉴别区分具有局限性。本研究中,作为形态学鉴别的补充,我们建立了一个基于SYBR GreenⅡ荧光染料和一个基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR齿瓣石斛鉴别体系。这两种方法中所使用的特异位点均位于核核糖体DNA内转录间隔区(nrDNA ITS)序列中。首先,在SYBR GreenⅡ real-time PCR齿瓣石斛鉴别体系的建立中,我们使用Primer Premier6设计并由Oligo6.0评价获得数对位点特异性鉴别引物。经验证,其中两对高效稳定的鉴别引物ITS1-F/ITS1-R和ITS2-F/ITS2-R被挑选出来共同用作鉴别体系,分别扩增ITS1和ITS2区域的163bp和159bp的片段。我们可以发现使用这两对引物可以检测齿瓣石斛及其相似种具有显著性差别(P<0.001,[SPSS]),齿瓣石斛Ct值分别为15.94(引物对:ITS1-4F/ITS1-4R)、16.38(引物对:ITS2-1F/ITS2-1R),相似种Ct值均值分别为34.94(引物对:ITS1-4F/ITS1-4R)、34.67(引物对:ITS2-1F/ITS2-1R)。其次,在TaqMan探针实时荧光定量PCR鉴别体系中,我们设计并验证筛选了两套探针/引物组TaqMan-DdITS1P/(TaqMan-DdITS1F/TaqMan-DdITS1R)、TaqMan-DdITS2P/(TaqMan-DdITS2F/Taq Man-DdITS2R),成功鉴别了齿瓣石斛及其相似种,以及紫皮枫斗及其混淆品,并应用于紫皮枫斗粉末及其混淆品粉末不同比例掺杂品的定量鉴定。  本文还尝试建立了一种基于SSR标记的药材鉴别体系,用于鉴别未知来源的枫斗。以齿瓣石斛、铁皮石斛,及细茎石斛的药材为研究对象,筛选对三个物种均具有通用性的SSR标记,依据SSR标记评价物种间的遗传分化水平,进而针对5个未知样本从个体水平和物种水平统计分析,准确检测出未知样本中石斛来源。  本文的研究表明:SYBR GreenⅡ、TaqMan probe、SSR鉴别体系均可为药检部门检测枫斗类药材真实性提供可靠的方法。
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