阿尔茨海默病(Alzheimer’ s Disease,AD)是最常见的引起痴呆的中枢神经系统退行性疾病,从明确诊断到患者死亡通常只有3-9年时间。中国现已诊断明确的AD患者达900万,且随着我国医疗水平的不断提高,人均寿命的不断延长,AD患病人数正以每年至少30万的速度增长。这一现象表明,AD已经成为当今社会所面临的重大医疗卫生难题,将给我国的医疗卫生事业带来沉重的负担。AD的主要病理特征为细胞外β淀粉蛋白(β-amyloid,Aβ)沉积和细胞内过量的Tau蛋白磷酸化形成神经纤维缠结(Neurofibrillary tangles,NFTs),从而引起氧化应激和慢性炎症损伤,导致突触功能障碍和神经元丢失等。AD的淀粉蛋白假说(amyloid hypothesis)指出脑内过多的Ap肽,尤其是Ap 42及其可溶性Aβ微聚体的存在是引起包括老年斑形成,神经纤维缠结,突触毒性损伤,导致突触功能障碍,以及神经元死亡的主要原因。因此,基于对AD病理特征认识,针对Ap和NFTs的治疗被视为AD治疗的主要方向,但经过数十年的研究并未取得长足进展。近年来,随着人们对p淀粉蛋白前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)本身及其处理途径的认识不断深入,人们越来越重视APP降解产生Ap的关键酶,即APPβ位点剪切酶1(β-site APP cleaving enzyme 1,BACE1)在AD发病中的作用。研究表明在AD动物模型和AD病人脑中,BACE1的蛋白水平和活性都显著升高,而BACE1的表达水平与活性在APP蛋白裂解和AD病理发生发展过程中至关重要。因此,许多研究人员都将AD的治疗重点转向对BACE1的抑制。已有大量研究表明BACE1基因删除或表达抑制后,Ap生成显著减少甚至消失,AD病理症状明显改善。另一方面,研究人员们评估了BACE1表达水平与酶活性改变后对正常生理表现和行为学的影响。动物实验表明BACE1敲除后并不会引起异常行为表现或显著的病理改变。因此,寻找BACE1相关的抑制因子对AD治疗具有里程碑意义。精神分裂症断裂基因(Disrupted in Schizophrenia 1, DISCI)是导致精神分裂症、双向从格障碍等多种精神疾病的重要基因。DISCI主要表达于脑,其中尤以海马齿状回中表达最高,在中枢神经系统中发挥着重要作用,如神经前体细胞的增殖、迁移、分化,突触可塑性的调控,轴突生长等。而且DISCI可与多种蛋白相互结合,发挥着支架蛋白的作用,包括基因转录、线粒体转运、肌动蛋白细胞骨架调节、神经元迁移、谷氨酸传递等。成体海马神经发生过程中涉及的多种信号通路,如AKT、GABA、GSK3B、Wnt、NMDA-R信号传导通路中,DISCI都直接或间接参与调控。在胚胎和成体神经发生过程中,DISCI通过与GSK3β直接结合并抑制其活性,从而降低β-catenin的磷酸化,减少β-catenin泛素化降解,导致β-catenin在细胞质内聚积。APP与DISCI可通过直接相互结合,调节神经元迁移,而且在这一过程中,DISCI发挥着APP及DAB下游信号的作用,APP敲除会引起培养神经元中DISCI亚细胞定位改变。当DISCI敲除后,成熟皮层神经元中APP经α分泌酶降解增多,产生更多的sAPPa,而Ap 40和Ap 42产生显著减少。这表明DISC1-APP蛋白复合体对APP蛋白裂解途径至关重要。这些结果表明DISCI可以通过蛋白结合直接或间接地调控下游蛋白的水平。而且,全基因组关联分析发现DISCI的一个SNP (SNP 1q42, rs12044355)与AD发病有显著相关性。而且,许多神经精神症状,如情感和社会行为异常等都在AD病人中有所表现。本研究发现,8个月龄大的APP/PS1双转基因小鼠海马和皮层中DISCI表达降低。本研究还证实DISCI通过与BACE1相互结合,促进BACE1蛋白溶酶体途径降解。APP/PS1双转基因小鼠海马中DISCI过表达可以降低Aβ水平,减少老年斑,并改善小鼠的学习记忆能力。第一章DISC1基因在阿尔茨海默病APPswe/PSIdE9转基因模型小鼠脑中表达情况的研究目的：研究APP/PS1双转基因小鼠脑中DISCI的表达情况。方法：抓取3对4个月龄和8个月龄大的野生小鼠和APP/PS1双转基因小鼠,麻醉后断颈处死小鼠后立即剥离鼠脑,分离海马和皮层,液氮冻存。取部分冻存的鼠脑海马和皮层提组织总蛋白,进行凝胶电泳和免疫印记检测DISCI蛋白水平。结果：在4月龄大小时,APP/PS1双转基因小鼠与同龄野生小鼠无论是海马还是皮层,其DISCI蛋白表达水平均没有显著差异(皮层：t=1.835,P=0.208;海马：t=0.499,P=0.667)；而在8月龄大小时,APP/PS1双转基因小鼠大脑皮层和海马中DISCI蛋白水平均显著低于野生小鼠皮层和海马中DISCI蛋白水平,差异有统计学意义(皮层：t=17.085,P=0.003；海马：t=20.949,P=0.002)。结论：APP/PS1双转基因小鼠在8个月龄大小时,DISCI基因表达显著降低；阿尔茨海默病与精神分裂症有共同的异常表达基因,二者可能具有内在相关性。第二章DISC1过表达特异性下调BACE1蛋白水平目的：探索DISC1对BACE1的调控作用。方法：培养HEK293细胞,将DISC1-Flag质粒与BACE1-HA质粒共转染作为实验组,并将GFP质粒与BACE1质粒共转染作为对照,检测转染后BACE1-HA的蛋白水平和RNA水平；培养HEK293细胞,分别转染DISC1-Flag质粒或GFP质粒后,检测内源性BACE1的蛋白水平和RNA水平；培养HEK293细胞,分别转染DISCI干扰RNA或对照干扰RNA,检测DISCI与BACE1蛋白水平和RNA水平。结果：培养的HEK293细胞用DISC1-Flag质粒和BACE1-HA质粒进行共转染,48小时后收样检测BACE1-HA的表达水平发现,过表达DISCI显著降低了BACE1的蛋白水平,且差异有统计学意义(t=11.358,P=0.008)；因为HEK293细胞内源性表达BACE1,因此,我们用DSIC1-Flag质粒转染HEK293细胞,并于转染后48小时后检测细胞内源性BACE1蛋白,发现过表达DISCI能显著降低HEK293细胞内源性BACE1蛋白水平,且差异有统计学意义(t=6.071,P=0.026)。人DISC1基因干扰RNA转染HEK293细胞后,HEK293细胞DISC1蛋白水平显著比转染对照干扰RNA的细胞的DISC1蛋白水平要低,而BACE1蛋白水平显著增高,二都差异有显著的统计学意义(DISCI:t=26.421, P=0.001; BACE1:t=5.292, P=0.034)。但是,HEK293细胞做为实验细胞,分别转染DISC1-Flag质粒和DISC1干扰RNA及相应的对照后,提取细胞总RNA进行逆转录PCR检测DISC1和BACE1的RNA水平发现,转染DISC-Flag可以显著提高DISC1的RNA水平,而转染DISC1-siRNA可以显著降低DISC1的RNA水平,但是无论何种调控DISC1表达,BACE1的RNA表达量均没有显著改变。结论：DISC1可以特异性调控BACE1蛋白水平,但是对BACE1的RNA表达没有调控作用。第三章DISG1过表达特异性下调BACE1蛋白水平的机制研究目的：探索DISC1调控BACE1蛋白水平的分子机制。方法：培养HEK293细胞进行细胞爬片,用DISC1-Flag质粒与BACE1-HA质粒共转染,24小时后用4%多聚甲醛固定细胞爬片,进行免疫荧光染色,检测DISC1-Flag与BACE1-HA共定位情况；培养HEK293细胞,用DISC1-Flag质粒与BACE1-HA质粒共转染,24小时后收样提总蛋白,分别用HA抗体和Flag抗体进行免疫共沉淀,检测DISC1-Flag和BACE1-HA的相互结合情况；取2月龄大小野生型小鼠的海马,提海马组织总蛋白,分别用DISC1抗体和BACE1抗体进行免疫共沉淀检测小鼠海马中DISC1与BACE1的相互结合情况。培养HEK293细胞,分别转染DISC1和GFP,18小时后用CHX处理,分别于处理0、8、16小时细胞收样检测BACE1蛋白水平；培养HEK293细胞,分别转染DISC1和GFP,转染后立即用DMSO (Vehicle)、CQ、MG132处理,48小时后收样检测BACE1蛋白水平。结果：HEK293细胞中共转染DISC1-Flag和BACE1-HA,用Flag抗体和HA抗体进行免疫荧光染色检测,发现DISC1与BACE1有共定位,而且均位于细胞核周围域；对共转染的细胞提取细胞总蛋白进行免疫共沉淀,分别用Flag抗体和HA抗体去拉下DISC1-Flag和BACE1-HA,进行免疫印记检测发现BACE1-HA可以拉下DSIC1-Flag,DISC1-Flag也可以拉下BACE1-HA;取2个月龄大的C57BL/6J小鼠鼠脑海马,提取组织总蛋白并分别用DISC1抗体和BACE1抗体进行免疫共沉淀检测,发现DISC1与BACE1在小鼠脑内仍有直接相互结合作用这些结果表明DISC1与BACE1有直接的相互结合。CHX药物实验发现DISC1转染后BACE1于药物处理后8小时和16小时,BACE1蛋白水平要显著低于对照组,差异有统计学意义(8h:t=3.504, P=0.013; 16h:t=2.611, P=0.040);CQ和MG132药物实验发现CQ能抑制BACE1的降解,并可抑制DISC1转染后对BACE1降解的促进作用,CQ处理后DISC1转染组与对照组BACE1蛋白水平没有显著差异(t=0.519,P=0.631),但是MG132处理不能抑制BACE1的降解作用,也不能抑制DISC1转染后对BACE1降解的促进作用(t=5.495,P=0.005)。结论：DISC1与5ACE1有直接的物理结合,而且DISC1通过溶酶体途径促进BACE1蛋白降解；BACE1主要通过溶酶体途径降解。第四章DISC1过表达改善APPswe/PSIdE9转基因模型鼠神经病理和认知功能目的：研究DISCI对内源性BACE1的调控作用,以及DISCI对APP/PS1双转基因小鼠脑中老年斑形成的影响和对AAPP/PS1双转基因小鼠记忆障碍的影响。方法：将小鼠分为WT+GFP(野生型小鼠注射GFP病毒)、TG+GFP (APP/PS1小鼠注射GFP病毒)、TG+DISC1 (APP/PS1小鼠注射DISC1病毒)三组,每组15只,于4个月龄大小时分别给小鼠海马注射GFP病毒和DISC1病毒,并于病毒注射后3.5月进行水迷宫检测评估DISC1对小鼠学习认知功能的作用。水迷宫检测结束后,将所有小鼠全部麻醉后断颈处死,立即剥离脑组织分成左右两部分。一侧用4%多聚甲醛固定后蔗糖脱水,冰冻切片以进行免疫荧光检测。另一部分脑组织分离海马和皮层后-80冻存,用于检测相关生化指标。取小鼠的冰冻切片用6E10抗体做免疫荧光染色检测小鼠脑中老年斑的数量和面积。取冻存的小鼠皮层和海马组织,按ELISA试剂盒提供的方法步骤进行组织样本制备后进行ELISA检测Aβ40和Aβ42的水平。取冻存的海马组织提取总蛋白后进行免疫印记检测APP、α/β-CTF、DISC1-Flag的表达情况,并统计表达水平。结果：免疫荧光染色和免疫印记检测结果证实病毒可以准确注射到小鼠海马齿状回并稳定表达至少4个月,而且小鼠海马中过表达DISCI后下调了海马中BACE1蛋白水平,差异有统计学意义(t=13.984,P=0.005)；而DISC1过表达不能改变BACE1的RNA表达水平,结果与体外实验结果一致。水迷宫实验结果显示对照组APP/PS1转基因小鼠逃生潜伏期和逃生距离显著长于野生小鼠和DISCI病毒注射组APP/PS1转基因小鼠(Day6:F=10.057,P=0.001);而三组小鼠的游泳速度没有显著差异,说明三组小鼠间的逃生潜伏期和逃生距离的差异不是游泳速度不同引起的;反向平台实验中对照组APP/PS1小鼠的逃生潜伏期也显著长于DISCI病毒注射组小鼠和野生型小鼠(Dayl:F=4.468, P=0.022, Day2: F=15.834, P=0.000)。对照组与DISC1组APP/PS1转基因小鼠海马免疫印记结果显示DISCI病毒注射可以降低β-CTF水平(t=5.252,P=0.013),而α-CTF(t=1.615,P=0.205)和APP (t=0.742, P=0.512)则没有显著改变。ELISA结果显示两组APP/PS1小鼠皮层中Aβ40(t=0.906, P=0.386)和Aβ 42(t=0.112,P=0.913)水平基本相同,而DISCI病毒注射组APP/PS1小鼠海马中Aβ 40和Aβ42水平显著要低于对照病毒组APP/PS1小鼠海马中Aβ40和Aβ42水平(Ap 40:t=10.696, P=0.000; Aβ 42:t=16.293, P=0.000).老年斑免疫荧光检测结果提示与对照病毒组APP/PS1小鼠相比较,DISC1病毒注射组小鼠海马中老年斑的数量和面积都要显著减少(数量：t=9.475,P=0.000；面积：t=6.799,P=0.000);而两组小鼠皮层的老年斑数量和面积没有差异(数量：t=0.204,P=0.840；面积：t=0.573,P=0.570)。结论：DISC1过表达能下调小鼠海马内BACE1蛋白水平,但不影响其RNA水平；DISC1过表达可以通过下调BACE1蛋白水平减少其对APP的淀粉蛋白途径降解,从而降低海马中p-CTF、Aβ40、Aβ 42水平,并最终减少老年斑形成；海马注射DISC1过表达病毒可以改善APP/PS1双转基因小鼠的认知记忆能力。