石斑鱼（Epinephelus spp）属于鲈形目（Perciformes）、鳍科（Serranidae）、石斑鱼（Epinephelus）属,是石斑鱼亚科（Epinephelinae）鱼类的总称。蛋白质的变化是石斑鱼冷藏期间品质下降的重要原因,因此本课题针对点带石斑鱼（Epinephelus coioides）冷藏过程中的品质评价、蛋白变化以及内源性蛋白酶的作用机制开展了研究:首先分析石斑鱼贮藏过程中的品质劣变规律,研究了冷藏条件下石斑鱼鱼片的理化以及微生物的变化,并建立QIM（Quality index method,质量指数法）评估方案,利用近红外光谱及低场核磁共振建立回归模型,实现了对冷藏石斑鱼品质的快速无损评估,为冷藏石斑鱼片的品质控制提供技术支撑;然后通过研究冷藏过程中不同包装方式下石斑鱼肌肉蛋白质氧化以及降解规律,从蛋白质生化特性的变化角度揭示石斑鱼品质变化机理;通过蛋白质组学技术获得了冷藏石斑鱼鱼片冷藏期间的蛋白质组变化并确定了潜在的鲜度指示蛋白,通过差异蛋白质与品质指标之间的相关分析揭示了品质下降的潜在机理;研究了内源性蛋白酶对石斑鱼肌肉冷藏期间质构劣变和风味物质变化的贡献,确定了内源性蛋白酶在石斑鱼肌肉品质下降中的作用和引起质构劣变的关键蛋白酶种类;最后利用组织蛋白酶B、L、D和钙激活蛋白酶分别与提取的石斑鱼肌原纤维蛋白建立降解模拟体系,采用液相色谱-串联质谱联用技术（LC-MS/MS）探讨了蛋白酶在肌原纤维蛋白降解中的作用模式。具体研究内容及结果如下:1.本研究建立了石斑鱼QIM方案,并利用近红外光谱、低场核磁共振和化学计量学方法实现了对冷藏石斑鱼片的快速无损检测。质量指数分值与冷藏时间之间呈现线性关系,其方程为QI=1.179×t-1.157（R²=0.98）,质量指数法结合微生物指标确定4℃条件下石斑鱼片的保质期为12天,PLS（Partial least squares,偏最小二乘法）分析表明QIM方案预测时间与实际时间的误差接近1天（均方根误差为0.984）。相关性分析表明QI分值与TVB-N（Total volatile base nitrogen,挥发性盐基氮）值高度相关。采用一阶导数、标准正态变量变换、多散射校正等多种光谱预处理方法,利用PLS、PCA（Principal component analysis,主成分分析）和MLR（Multiple linear regression,多元线性回归）方法建立了冷藏石斑鱼TVB-N值的近红外光谱预测模型,结果表明,标准正态变量变换结合PLS建立的预测模型拟合精度和预测能力最佳,预测方程系数Rp为0.968,其均方根误差为1.381。低场核磁共振弛豫时间多元回归模型对TVB-N的预测值均方根误差为1.883,R²=0.96,能够精准预测石斑鱼肌肉的TVB-N含量,结合伪彩图所展示内部的水分状态,能够实现对冷藏石斑鱼片鲜度的无损快速检测。2.探讨了冷藏过程中不同包装方式下石斑鱼肌肉蛋白质氧化以及降解规律,以新鲜石斑鱼背部肌肉为对象,普通包装、真空包装、气调包装三种包装方式被用于实验,测定了肌原纤维蛋白羰基、巯基、Ca²⁺-ATPase活性、表面疏水性、TCA可溶性肽、MFI（Myofibril fragmentation index,肌原纤维小片化指数）、游离氨基酸、傅里叶变换红外光谱以及总蛋白SDS-PAGE电泳等指标。结果表明,冷藏期间蛋白质的石斑鱼肉蛋白质氧化程度逐渐升高;傅里叶变换红外光谱冷藏期间石斑鱼肌肉二级结构α-螺旋向无规则卷曲转化;总蛋白SDS-PAGE电泳证实了冷藏期间肌球蛋白重链和肌动蛋白不断降解。真空包装和气调包装显著抑制了石斑鱼片肌肉蛋白的氧化与降解,蛋白质的氧化和降解高度相关。3.采用基于TMT（Tandem Mass Tag,串联质量标签）的蛋白质组学策略用于阐明在冷藏过程中石斑鱼肌肉蛋白质组的变化。另外对石斑鱼片的p H、离心损失、颜色（L*、a*和b*）和质地（硬度、耐嚼性和胶粘性）分别进行了分析。在第0天与第6天组的比较以及第0天与第12天组的比较的结果中,总共发现了65种DSEP（Differentially significant expressed proteins,差异显著表达的蛋白质）。相对于第0天与第6天的差异蛋白比较,在第0天与第12天的对比中发现了更多的蛋白质的变化。利用生物信息学比如Uni Prot蛋白数据库、基因本体论（Gene Ontology,GO）富集、京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）和蛋白质相互作用网络（Protein-protein interaction network,PPI）分析了所有的DSEP。所有DSEP按照功能分为七个领域:结合蛋白、钙处理、酶、热休克蛋白、转运蛋白、结构蛋白和其他。与p H值、离心损失、颜色（L*、a*和b*）和质地（硬度、耐嚼性和胶粘性）密切相关的蛋白质数量分别为4、3、6和8个。4.比较了内源性蛋白酶和微生物在冷藏石斑鱼片的质构软化和风味物质变化的不同作用。分别采用碘乙酸和proclin300抑制内源性蛋白酶活性和微生物生长。结果表明碘乙酸很好地抑制了内源性蛋白酶的活性,并且未显著影响微生物生长,proclin300处理的样品细菌总数和假单胞菌属菌数在第18天的时候分别低于2 log CFU g^-1和1 log CFU g^-1,同时未对蛋白酶活性有显著影响。第6天时碘乙酸处理组硬度下降了8%,而proclin300处理组下降了28%,并且游离氨基酸、挥发性物质的变化显著超过了碘乙酸处理组,说明内源性蛋白酶是石斑鱼肌肉硬度下降的主要因素。一级衰减指数拟合表明组织蛋白酶L是石斑鱼片硬度下降最关键的蛋白酶,而游离氨基酸、挥发性物质的含量变化则表明微生物在风味物质劣变中起主要作用,内源性蛋白酶对风味的影响有限。微生物对石斑鱼的质构影响几乎可以忽略,但是在风味物质变化中的作用则强于内源性蛋白酶。5.研究了内源性蛋白酶对石斑鱼肌肉降解机制。利用外源提纯的组织蛋白酶B、L、D和钙激活蛋白酶体外降解石斑鱼肌原纤维蛋白,分析了蛋白酶在肌原纤维蛋白降解中的作用机制,并采用LC-MS/MS技术鉴定每一种酶降解肌原纤维蛋白产生的所有的可鉴定蛋白质及其降解产物,进而确定每一种酶类在肌原纤维蛋白降解中的贡献。LC-MS/MS的蛋白质鉴定结果发现石斑鱼肌原纤维蛋白肌球蛋白重链、肌球蛋白轻链、肌动蛋白的水解能力顺序为组织蛋白酶L>组织蛋白酶B>组织蛋白酶D>钙激活蛋白酶;组织蛋白酶L单独降解石斑鱼肌原纤维能力尤其突出,够显著降解肌球蛋白重链、肌球蛋白轻链、热休克蛋白HSP70、LIM结构域结合蛋白3等;钙激活蛋白酶可以降解肌钙蛋白T和肌间线蛋白,组织蛋白酶L降解热休克蛋白HSP70,推测HSP70为钙激活蛋白酶的竞争性底物,所以组织蛋白酶L和钙激活蛋白酶在降解肌原纤维蛋白的过程中存在着协同效应。