背景细菌内毒素是注射剂中的主要致热物质,可引起发热、微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血。内毒素检测方法的灵敏性和准确性关系直接关系到检测结果可靠性,目前我们使用的是凝胶法检测,仅为限度判断,在疫苗质量检定上,可靠性和精准性是基本准则,因此建立细菌内毒素定量检测法很有必要。方法本研究根据2015版《中国药典》四部通则1143“细菌内毒素检查法”规定,对现有限度法检测得出的内毒素结果进行分析,同时拟建立动态浊度法进行定量检测,针对准确度、精密度、专属性、定量限、线性、范围和耐用性各项进行方法学验证。方法学验证完成后,进行各样品的适应性验证试验,并作出总结,对样品中可能存在的干扰及干扰的消除进行实验和分析,确定各个供试品的实际需要稀释倍数,做出应用评价。结果动态浊度法建立,方法学验证结果如下:(1)准确度:各组数据回收率均值为100±30%,回收率符合50%～200%的要求;(2)精密度:取3个不同浓度内毒素,每个浓度平行测定3次,结果相同浓度的结果RSD不大于1,再采用同一份样品进行6次平行测定,RSD不大于0.85,符合重复性RSD不大于1的要求;(3)专属性:采用Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗单价原液,肠道病毒71型灭活疫苗原液、Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗、肠道病毒71型灭活疫苗和冻干甲型肝炎减毒活疫苗五个重要样品进行检测,可以不被杂质影响,准确检测出其中的细菌内毒素含量;(4)定量限:在标示灵敏度范围内,进行0.015EU/ml、0.020EU/ml和0.025EU/ml三个低浓度点的实验,测试结果回收率75~110%,回收率符合50~200%的要求,定量限可达0.015EU/ml;(5)线性(标准曲线可靠性):4次实验,每次采用不同的稀释最低点浓度和不同的倍数,R2分别为:0.994、0.986、0.982和0.988,符合R2大于0.98的要求;(6)范围:在鲎试剂标示灵敏度0.015~10.0EU/ml范围内,回收率在90%～120%较窄范围之间,回收率符合要求;对鲎试剂标示灵敏度范围的±20%进行测定,结果显示,检测上限可适当延伸至12.0EU/ml,但下限不可延伸;(7)耐用性:选取不同蛋白含量和不同pH值,以及不同生产环节中间产品做比对。具体分别选取pH值为6.8、7.2和人为调节至8.5三个批次的EV71;蛋白质含量为2.3ug/剂、3.3 μg/剂和3.9 μg/剂的三个批次的sIPV;以及同批次纯化液和原液进行了测试;各组结果数据几乎无差异,符合结果不受影响的要求,耐用性良好。系统的对各个疫苗需要检测内毒素的样品进行初步试验,结果如下:各样品的适应性试验,回收率均符合要求,说明该方法与我所产品的适应性良好,结果准确可靠;采取加大样品稀释倍数的方法,解决了牛血清这类容易出现阳性干扰的动物源样品的检测问题。结论研究成功建立了细菌内毒素动态浊度定量检测方法,并按照药典《药品质量标准分析方法验证指导原则》进行了方法学验证,各指标验证结果均符合标准要求;运用该方法对我所各个制品进行的细菌内毒素检测,各样品的适应性良好,可以应用到日常检测。