外泌体是一种直径为30-150 nm的细胞外囊泡,其起源于内涵体,在成熟的晚期内涵体（多胞体）质膜与细胞膜融合将外泌体分泌到细胞外和外周血。外泌体中有多种类型的分子,其中包括蛋白质、脂质、RNA和DNA等。外泌体参与细胞间物质交换和信息传递,发挥着重要的生物学功能。许多研究表明外泌体与肿瘤的进展和转移密切相关,外泌体中表达的某些特定蛋白质可以作为某些肿瘤靶向特定器官转移的特异性标志物。验证特定蛋白质表达的外泌体有望发展为肿瘤转移的血液标志物。骨肉瘤（osteosarcoma）为骨组织原发恶性骨肿瘤,其基本诊断特征是恶性肿瘤细胞产生肿瘤性骨及骨样组织,是最常见的恶性程度很高的骨肿瘤,好发于青少年,早期容易发生靶向肺的肿瘤转移,而且缺乏早期诊断技术,严重影响骨肉瘤患者的预后,危害青少年身心健康,为此探索和建立一种能早期诊断骨肉瘤并预警肺转移的有效检测手段显得尤为重要。考虑到血液中肿瘤细胞分泌的外泌体对肿瘤的发生、发展和转移的重要作用,针对外泌体特定蛋白表达与转移靶器官的紧密性和骨肉瘤易发生肺转移的特点,为了探讨和验证外泌体在骨肉瘤肺转移的作用,建立以外泌体为标志物的骨肉瘤肺转移早期诊断新技术,本文进行了如下研究。第一章骨肉瘤细胞外泌体的提取和鉴定目的培养多种骨肉瘤细胞系,从细胞上清液中提取出骨肉瘤细胞外泌体并对其进行表征和鉴定,验证CD63分子定位于骨肉瘤外泌体的表面。方法选取多种骨肉瘤细胞系（HOS、MG63、KHOS-240S、Saos-2）进行传代培养,收集细胞上清液,用超高速离心和外泌体试剂盒提取外泌体;用透射电镜观察经负染的外泌体的形态,纳米颗粒跟踪分析技术测量外泌体的粒径和浓度,western blotting验证外泌体中特征型蛋白标记物;用纳米金标记的二抗与抗CD63分子特异性结合,通过TEM观察经过负染的外泌体膜表面是否结合有金颗粒。结果用超高速离心提取外泌体可以看到离心管底部有乳白色沉淀;透射电镜下可以观察到由完整双层膜包绕,呈现圆形、椭圆形、直径约为50-150 nm左右的典型囊泡状结构,并且可以看到杯口状结构;NTA检测外泌体直径主要分布在70-200 nm范围,浓度为9.55×10⁸/mL,浓度达到峰值的颗粒直径在127 nm左右,平均直径为150 nm左右;western blotting验证了骨肉瘤细胞及其外泌体中CD63和TSG 101的表达;通过免疫电镜可以看到呈圆形、椭圆形、直径约为50-150 nm左右的外泌体囊泡,在囊泡膜的表面有数个直径约为10 nm左右的黑色小圆点。结论骨肉瘤细胞能够分泌外泌体且已被成功提取,验证CD63定位于外泌体膜上而非包裹在外泌体囊泡内部。第二章骨肉瘤细胞外泌体中整合素蛋白的验证目的验证整合素在骨肉瘤外泌体中的表达,探索外泌体在体内介导骨肉瘤肺转移的作用机制。方法通过RT-PCR分析骨肉瘤细胞外泌体中整合素基因的表达;用western blotting分析骨肉瘤细胞外泌体中与肺转移相关的整合素的表达;以所提取的外泌体为媒介,用裸鼠建立骨肉瘤肺转移动物模型,研究骨肉瘤外泌体对肺组织局部微环境的影响;用试剂盒提取骨肉瘤患者血清外泌体,用TEM和western blotting进行血液标本的检测。结果RT-PCR证实了整合素α₆和β₁在骨肉瘤外泌体的表达水平明显高于正常成骨细胞的外泌体,western blotting也验证了骨肉瘤细胞外泌体中表达整合素蛋白;骨肉瘤患者血液中的外泌体也表达特异性标志蛋白CD63分子和整合素α₆;裸鼠肺组织免疫组化结果显示,经过骨肉瘤外泌体处理的裸鼠肺组织中的ITGα₆、MMP-2和MMP-9的表达明显要高于空白对照组。结论与正常成骨细胞相比,整合素在骨肉瘤外泌体中的表达升高;骨肉瘤细胞分泌的外泌体能改变肺组织局部微环境,有利于骨肉瘤的定植和转移。第三章可用于骨肉瘤外泌体均相测定的荧光信号的建立目的合成稳定可靠的氮掺杂碳量子点（N-CDs）,明确N-CDs均相体系下荧光变化与pH的关系,建立以N-CDs为基础,基于pH改变的荧光信号响应体系方法用柠檬酸、谷胱甘肽和多乙烯多胺为原料,通过简单的两步热分解法合成一种氮掺杂的碳量子点;透射电子显微镜表征N-CDs的形貌特征,傅里叶变换红外光谱和X射线光电子能谱分析研究N-CDs的官能团、元素结构和组成,紫外可见吸收光谱和荧光光谱分析N-CDs的光学性质;设置一系列不同浓度的盐溶液,检测N-CDs的离子强度耐受性;在最适激发波长下连续照射N-CDs,检测N-CDs的抗光漂白性;设置一系列不同pH的反应体系,检测N-CDs的荧光强度变化,分析N-CDs的荧光强度与pH的关系;引入脲酶催化尿素分解的pH变化体系,借助已建立的N-CDs的荧光强度与pH的关系,测定脲酶浓度。结果合成的N-CDs是一种大小均一的平均粒径为5.6 nm的近球形颗粒,具有的典型晶格空间距离为0.22 nm,主要由C、N、O、S等元素构成,其表面富含-NH₂和-OH。溶于水的N-CDs在日光下呈黄色,在紫外灯下发出蓝色荧光,在波长为350 nm的最适激发光的激发下,N-CDs在450 nm处具有最大发射荧光强度,而且能耐受高强度离子的干扰,具有良好的抗光漂白性质。N-CDs在450 nm处的最大荧光强度随着pH升高而逐渐减弱,当pH值的范围在3.0-9.0时,N-CDs的荧光强度与pH值具有良好的线性关系,经计算得出线性方程为Y=-97.924[pH]+1043.85,R²=0.9888。当脲酶浓度范围在5-800 U/L时,N-CDs的荧光强度与脲酶浓度具有良好的线性关系,线性方程式Y=-0.2809C_{urease（U/L）}+487.276,R²=0.9960,检测限可达4.5 U/L,而且葡萄糖、半胱氨酸以及其他干扰物质几乎不影响N-CDs对脲酶的检测。结论成功获得了荧光可随pH变化而灵敏调节的氮掺杂碳量子点,通过引入脲酶和尿素反应体系,为外周血中骨肉瘤外泌体的检测提供了灵敏可靠的均相信号响应体系。