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背景目的:中波紫外线(UVB)的过度暴露会损伤各种生物大分子,诱导炎症反应,抑制增殖和促进细胞衰老与死亡。UVB是太阳光中紫外线致癌的主要因素。皮肤是人体最大的器官,也是最易遭受UVB损伤的器官。UVB的穿透力弱,仅能到达表皮层,因此相关研究主要采用占表皮细胞主体的角质形成细胞。UVB致角质形成细胞的各种损伤多与活性氧(ROS)蓄积导致的氧化应激密切相关。细胞中90%的ROS来自于线粒体,同时线粒体也是ROS清除的主要场所。线粒体中的多种酶参与ROS的清除,包含超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)和过氧化氢酶(catalase)等。正常生理条件下,ROS的水平会维持在极低有利无害的水平。角质形成细胞被UVB照射会引起细胞内ROS水平显著增加,这与线粒体中抗氧化酶活性的下降密切相关。乙酰化修饰是影响线粒体中抗氧化酶活性的主要方式,定位在线粒体的去乙酰化酶SIRT3在角质形成细胞中的研究很少。本研究选用HaCaT这种UVB照射对表皮角质细胞的影响相关研究的成熟的体外模型。采用qRT-PCR和Western blot法检测了UVB对SIRT3转录和翻译水平的影响。鉴于SIRT3在细胞中的分布并不局限于线粒体,我们首次采用Western blot法对核浆蛋白和线粒体蛋白中SIRT3的表达水平及UVB对其影响进行了检测。为了探讨SIRT3在UVB导致的氧化损伤中的作用,检测了SIRT3过表达对UVB诱导的ROS生成及SOD2表达的影响。此外还检测了SIRT3过表达对HaCaT迁移能力及相关的Twist表达的影响。结果1.qRT-RCR和Western blot结果显示,低剂量UVB(30m J/cm~2)并没有改变而高剂量UVB(120m J/cm~2)显著下调了SIRT3的m RNA和蛋白水平。2.Western blot法检测核浆蛋白和线粒体蛋白中SIRT3的表达,结果显示正常培养和UVB照射HaCaT细胞,SIRT3均位于线粒体。高剂量(120m J/cm~2)UVB照射后浆蛋白和线粒体蛋白中SIRT3蛋白水平降低。3.采用DHE(二氢乙锭)-活性氧检测和Western blot检测发现,30m J/cm~2和120m J/cm~2剂量的UVB照射后HaCaT细胞ROS水平均升高,同时总蛋白中SOD2水平均降低。4.划痕实验结果显示,30m J/cm~2UVB照射后细胞迁移未见明显减慢,120m J/cm~2剂量UVB照射后显著抑制HaCaT细胞迁移。Western blot结果显示,Twist蛋白在120m J/cm~2剂量UVB照射后表达下降,30m J/cm~2剂量UVB照射后没有改变Twist的表达。5.SIRT3过表达下调120m J/cm~2UVB照射引起的ROS水平增高和SOD2蛋白的下降并逆转了UVB对细胞增殖能力和迁移能力的下调。结论1.生理剂量的UVB并未影响HaCaT细胞中SIRT3的转录和蛋白水平,而SIRT3的表达被高剂量UVB显著下调。2.HaCaT细胞中SIRT3主要位于线粒体,UVB照射后ROS水平的增高可能与SIRT3及SOD2表达的降低有关。3.SIRT3可能通过上调SOD2表达来保护HaCaT细胞免受UVB导致的氧化应激及其对细胞增殖和迁移能力的抑制。4.UVB对HaCaT迁移的抑制与Twist水平的降低有关。