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背景与目的近年来,三氧化二砷(Arsenic trioxide, AS2O3)治疗急性早幼粒细胞白血病(Acute promyelocytic leukemia, APL)引起了人们的广泛关注。它可以诱导APL达完全缓解,且没有明显的骨髓抑制作用,尤其是复发及难治APL患者。许多文献证明三氧化二砷对慢性粒细胞白血.病、骨髓瘤及淋巴瘤也有一定的疗效,但其作用机制尚不完全明确,有资料表明As203具有杀伤白血病细胞、促进白血病细胞凋亡和诱导细胞分化三重作用。另外它还发挥去甲基化作用,可使因甲基化而沉默的抑癌基因发生去甲基化而重新表达,产生抗癌作用。SHP-1基因是近年来发现的一种新的抑癌基因,主要表达在造血细胞中。有研究发现,SHP-1在各种白血病和恶性淋巴瘤细胞株中的表达水平下降。在K562细胞株中SHP-1基因不表达,在ATL、B-ALL细胞株中SHP-1基因表达减低。用MS-PCR(Methylation Specific PCR,MSP)的方法检测发现K562细胞株中SHP-1基因启动子区的CpG岛发生超甲基化。丙戊酸钠(Valproate acid,VPA)是治疗癫痫病的一种基本药物,近些年来许多资料表明VPA的主要机制是恶性细胞的增长抑制、诱导其分化,促进凋亡,而且近来研究表明其具有组蛋白去乙酰化酶抑制活性。有研究表明,DNA甲基化和组蛋白去乙酰化是阻碍抑癌基因表达的关键机制。近来有资料表明,抑癌基因的表达可阻碍一些甲基化敏感的转录因子结合于基因调控区,或者可以直接抑制RNA聚合酶的活性,还有可能通过组蛋白去乙酰化酶抑制作用实现。这发现把表观遗传学的两大机制结合起来,即阻碍DNA甲基化和组蛋白乙酰化诱导抑癌基因的表达。目前三氧化二砷和丙戊酸钠两种药物联合在白血病K562细胞系中的研究还较少。因此,本实验选择不同浓度As2O3联合VPA作用于白血病K562细胞系,观察二者体外对该细胞株增殖的抑制作用及其对抑癌基因表达的恢复作用。为As2O3单药或联合VPA应用于白血病治疗提供实验室依据。方法1.细胞培养：复苏冻存的K562细胞,将其接种在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中,培养在5%CO2培养箱中,定期换液,取对数生长期K562细胞进行实验。2.WST-1(水溶性四唑盐光吸收法)检测药物作用对细胞增殖的影响。分组如下：1)对照组(加入等量生理盐水)。2) As2O3组(终浓度设为2.5μmol/L、5.0μmol/L、7.5μmol/L10.0μmol/L)。3)VPA组(终浓度为4mmol/L)。4)联合用药组(终浓度为4mmol/LVPA分别与2.5μmol/L、5.0μmol/L7.5μmol/L、10.0μmol/L的As2O3联合)。K562细胞培养至对数生长期,细胞计数为2×106/L时,将细胞接种于96孔板中,分别加入上述四组药物,开始计时。并于24h,48h,72h用酶标仪检测细胞吸光度值(A),计算出增殖抑制率,找出最佳作用浓度及作用时间。3. RT-PCR(逆转录聚合酶链反应)法检测SHP-1mRNA的表达：将筛选出最佳作用浓度的As2O3及联合VPA分别作用于对数生长期的K562细胞株。分组如下：1)对照组(加入等量生理盐水)2)As2O3组(7.5μmol/L)3)联合用药组(As2O37.5μmol/L+VPA4mmol/L)4)VPA组(4mmol/L)上述各组药物与K562细胞培养至48小时提取RNA,设计SHP-1基因引物,扩增产物用1.5%琼脂糖电泳凝胶成像观察并拍照,相关软件分析电泳结果及灰度值。4. Western blot法检测SHP-1基因蛋白的表达：分组同上,在加药48h后收集K562细胞,并裂解制备蛋白样品,BCA法测蛋白浓度含量,SDS-PAGE电泳,在凝胶成像系统下观察并拍照,相关软件分析其灰度值。5.统计学分析：应用SPSS17.0统计学软件对所得结果进行分析,统计学数据以均数±标准差(x±s)表示。采用t检验比较两组样本的均数,单因素方差分析比较多组样本的均数。检验水准为a=0.05,P<0.05表示有统计学意义,即差异有显著性,P>0.05即差异屋显著性。结果1.细胞培养：As2O3、VPA及两药联合分别作用于对数生长期的K562细胞,细胞出现明显的增殖抑制,倒置显微镜下观察,与对照组相比,细胞胞体缩小、碎裂、形态不规整。2.WST-1法检测K562细胞各组药物作用对细胞增殖的影响：各药物浓度(2.5μmol/L、5.0μmol/L、7.5μmol/L、10.0μmol/L)的As203对K562细胞的增殖均有明显抑制作用,并有时间和剂量依赖性。在相同时间点,随着浓度的增加细胞增殖抑制作用越明显,与对照组比较及两两比较有统计学意义(P<0.05)；在相同浓度下,24h、48h、72h K562细胞增殖抑制作用逐渐增强,但与48h与72h相比无统计学意义(P>0.05),计算48h时对K562细胞的IC50值为6.38μmol/L。4mmol/L VPA与As203(2.5μmol/L、5.0μmol/L、7.5μmol/L)联合应用后可加强对K562细胞的增殖抑制作用,与同浓度单药相比有统计学意义(P<0.05),但(4mmol/L VPA+7.5μmol/L As2O3)联合组与(4mmol/L VPA+10.0μmol/LAs2O3)联合组比较无统计学意义(P>0.05)。3. RT-PCR扩增结果显示：对照组(加等量生理盐水)未见SHP-1mRNA条带,各药物组SHP-1mRNA均有表达,联合用药组(As2O37.55μmol/L+VPA4mmol/L)较单用As2O3组(7.5μmol/L)及VPA组(4mmol/L) mRNA表达明显,其灰度值相比有明显差异(P<0.05),As2O3组(7.5μmol/L)与VPA组(4mmol/L)比较亦有明显差异(P<0.05)。4. Western blot结果：对照组SHP-1蛋白无表达,VPA组(4mmol/L)蛋白弱表达,As2O3组(7.5μmol/L)及联合用药组(As2O37.5μmol/L+VPA4mmol/L)作用后蛋白表达明显。联合用药组(As2O37.5μmol/L+VPA4mmol/L)与两单药组及对照组比较有统计学意义(P<0.05),As2O3组(7.5μmol/L)与VPA组(4mmol/L)比较有统计学意义(P<0.05)。结论1.As2O3及VPA对K562细胞增殖有明显抑制作用,且有浓度和时间依赖性；As2O3与VPA联合后较同浓度的单药应用抑制作用增强。2.K562细胞中SHP-1mRNA和蛋白不表达。3.As2O3能诱导K562细胞SHP-1mRNA和蛋白重新表达；VPA亦能诱导SHP-1表达,但作用较As2O3弱。