论文部分内容阅读
甘蓝型冬油菜（Brassica napus L.）是我国主要的油料作物之一,具有产量高,抗倒伏、品质优良等特点,但在越冬前的幼苗时期,下胚轴伸长,导致生长锥暴露于土壤表面体积较大,植株容易受冻致死,严重制约了我国北方甘蓝型冬油菜的发展。因此,基于生长锥和下胚轴研究甘蓝型冬油菜的抗寒性,对解析甘蓝型冬油菜的抗寒性分子机制具有重要意义。本研究以12个甘蓝型冬油菜为研究材料,通过越冬率、春化率、半致死温度、形态特征和生理生化等指标对其抗寒性进行了鉴定,明确了生长锥相对高度和下胚轴长度与抗寒性的相关性,并对筛选的调控生长锥分化和下胚轴伸长的关键相关基因进行了功能分析。主要得到以下结果:1.越冬试验和春化试验表明,甘蓝型冬油菜的越冬率与春化率之间存在极显著负相关关系（相关系数为-0.964）,其中越冬率为7.6092.15%,春化率为11.6597.14%。在低温处理下,参试材料的相对电导率呈升高趋势,半致死温度(LT50)为-12.84-2.57℃;酶活性和细胞渗透调节物质含量明显升高,叶绿素含量下降,类胡萝卜素含量上升。采用层次聚类法进行聚类分析,结果表明,12个甘蓝型冬油菜的抗寒性可以分为四类,分别为强抗寒材料（TSG 10、TS309-4、NS45-4、TS309-3、TS309-10和NTS15）、抗寒材料（8（G）、TS312-2和天油2266）、弱抗寒材料（NPZ269-1和天油2288）和不抗寒材料（新油23号）。2.甘蓝型冬油菜生长锥和下胚轴具有较大差异。强抗寒材料（如TSG 10）生长锥高度较低,表面光滑透明,呈半球馒头形,分化能力迟缓,体积小,生长锥细胞排列紧密,细胞质浓,细胞核较大;弱抗寒材料（如天油2288）生长锥高度较大,表面有许多幼嫩组织突起,分化能力旺盛,体积较大,生长锥基部细胞排列疏松弥散,细胞间隙较大;下胚轴细胞在极端低温（-20℃）下,细胞皮层出现大量空腔和崩塌细胞,细胞壁发生融合,受损严重。3.甘蓝型冬油菜生长锥相对高度和下胚轴长度受叶龄、低温处理和播期影响较大。随着叶龄增加,生长锥相对高度不断增加,近根部下胚轴逐渐木质化范围向地上部延伸,下胚轴长度呈变短趋势;低温处理（4℃）较常温（25/20℃）,生长锥相对高度较小,下胚轴伸长速度较慢;秋播较春播处理,生长锥相对高度较小,下胚轴长度较短;相关性分析表明,生长锥相对高度和下胚轴长度均与抗寒性显著负相关。4.低温处理（4℃）较常温（25/20℃）,调控生长锥分化的关键相关基因为BnSTM基因,调控下胚轴长度的关键相关基因为BnHY5基因。BnSTM基因表达量与生长锥相对高度显著正相关,与甘蓝型冬油菜的抗寒性显著负相关;BnHY5基因主要在叶片和下胚轴表达。5.BnSTM基因编码蛋白质对生长锥分化的调控作用主要通过KNOX家族在茎分生组织的集中表达完成的,而BnHY5基因编码蛋白质对下胚轴长度的调控作用与bZIP超家族的BRLZ转录因子关系密切。克隆生长锥分化的正调控基因BnSTM和下胚轴伸长的正调控基因BnHY5的CDs序列,蛋白结构和功能预测结果显示,BnSTM基因包含1149bp完整ORF,编码382个氨基酸,属于KNOX家族,包含KNOX1、KNOX2、ELK和Homebox KN四个保守结构域,与天油2288、甘蓝型油菜、甘蓝和白菜型油菜的亲缘关系较近;BnHY5基因包含528bp完整ORF,蛋白编码175个氨基酸,属于bZIP超家族,包含一个BRLZ转录因子保守结构域,与天油2288和甘蓝型油菜的亲缘关系较近。亚细胞定位分析表明,BnSTM和BnHY5蛋白均在细胞核表达,与预测结果一致,同时,成功鉴定转基因BnSTM和BnHY5拟南芥阳性株系T1代。这些研究结果表明,生长锥相对高度和下胚轴长度与甘蓝型冬油菜的抗寒性密切相关,并且成功鉴定出生长锥关键相关基因BnSTM和下胚轴关键相关基因BnHY5,为甘蓝型冬油菜品种的抗寒选育提供了新方向,但关于BnSTM和BnHY5基因在抗寒过程中的分子机制还需进一步研究。