COX-2shRNA通过诱导肝星状细胞衰老改善肝纤维化的作用机制研究

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目的构建靶向COX2-shRNA慢病毒载体,观察COX-2shRNA对肝星状细胞衰老的影响,探讨其对肝纤维化的抑制作用及机制。方法1.构建3条COX-2shRNA序列至慢病毒载体GV248中,感染大鼠HSC-T6细胞株,通过实时荧光定量PCR技术筛选出干扰效率最高的COX-2shRNA序列。2.将干扰效率最高的COX-2shRNA慢病毒载体,通过尾静脉注射到高脂-CCL4诱导的肝纤维化模型大鼠中。12周末,处死大鼠。油红“O”染色(冰冻切片)、HE染色和Masson染色分析肝组织脂肪变性及纤维病变程度;β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老;实时荧光定量PCR检测肝组织匀浆COX-2mRNA、α-SMAmRNA、p53mRNA的表达。同时检测血清总胆固醇、甘油三酯、谷草转氨酶、谷丙转氨酶含量。3.以大鼠HSC-T6细胞株为研究对象,应用PFT-α抑制p53活性来研究p53通路在COX-2shRNA诱导HSC-T6衰老中的作用。β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老,CCK8检测细胞增殖,流式细胞仪测定细胞周期,q-PCR检测p53mRNA及p21mRNA的表达。结果1.通过qPCR对3条序列慢病毒干扰效率的筛选发现,COX-2-shRNA-1、COX-2-shRNA-2和COX-2-shRNA-3组分别与正常对照组相比,COX-2的表达均下降 84.7%、86.3%和 91.8%。2.动物实验研究表明:(1)HE染色显示,COX-2shRNA组与肝纤维化模型组相比,肝脂肪变性减轻。(2)油红“O”染色显示,COX-2shRNA组与肝纤维化模型组相比,大鼠肝组织脂变面积明显减少,差异有显著性(P<0.01)。(3)Masson染色显示,COX2shRNA组与肝纤维化模型组相比,大鼠肝组织胶原面积明显减少,差异有显著性(P<0.01)。(4)肝功能结果显示,与肝纤维化模型组比较,COX-2shRNA组大鼠血清AST、ALT、TC、TG水平均下降,差异有显著性(P<0.05)。(5)Q-PCR检测结果显示,与肝纤维化模型组大鼠比较,COX-2shRNA组大鼠肝脏组织中α-SMAmRNA、COX-2mRNA表达水平显著下调(P<0.01),p53mRNA表达水平显著增强(P<0.01)。(6)肝脏β-半乳糖苷酶染色结果显示,与肝纤维化模型组比较,COX2shRNA组肝组织细胞衰老指数明显增加,差异有显著性(P<0.05),说明COX2shRNA促进肝纤维化肝组织细胞衰老。3.细胞实验研究表明:(1)COX-2shRNA在HSC-T6细胞中的转染效率在90%以上;(2)COX-2shRNA病毒载体转染HSC-T6细胞后,β-半乳糖苷酶活性增加,细胞分裂阻滞在G0/G1期,衰老相关分子p53和p21表达增加;(3)CCK8检测结果显示,p53抑制剂PFT-α对HSC-T6细胞具有促进增殖的作用;(4)应用PFT-α抑制p53活性,COX2-shRNA病毒载体转染的HSC-T6细胞的β-半乳糖苷酶活性有所减弱。结论1.COX-2shRNA可抑制大鼠实验性肝纤维化的发生、发展,改善肝脏病理学改变。2.COX-2shRNA对大鼠实验性肝纤维化的保护作用可能与其下调COX-2基因表达,促进肝组织细胞衰老有关。3.COX-2shRNA可能通过P53信号途径诱导肝星状细胞衰老参与实验性肝纤维化的发生、发展。
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