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研究背景脂肪是人体重要的能量提供者,但是多余的脂肪往往导致肥胖等疾病,反而成为“废品”。肥胖、动脉粥样硬化、胰岛素抵抗等疾病都与脂肪组织功能障碍相关,脂肪的生长发育又与脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ASCs)的增殖、分化密切相关。ASCs是一类具有自我复制能力的多向分化潜能细胞,如成脂肪、成骨、成软骨、成肝细胞、成神经细胞样等分化。ASCs具有取材容易,来源广泛,适宜大规模培养等特点,为目前组织工程领域研究最活跃的成体干细胞之一。转录因子 CCAAT/增强子结合蛋白 α(CCAAT/enhancer binding protein α,C/EBPα)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptors,PPARy)是干细胞成脂分化的主要调控因子,它们促进脂肪特异基因表达,诱导干细胞成脂分化。MicroRNA(miRNA)是一类长约22 nt的具有调控功能的非编码RNA。它可通过碱基互补配对的方式,与靶基因全部或部分结合,降解靶基因或者阻遏靶基因的翻译,从而对细胞起调控作用。最近一些研究表明,miRNAs参与ASCs自我更新、增殖、多向分化等过程的调控。为了探索转录因子C/EBPα与miRNA的相互关系和利用miRNA精确地控制ASCs的定向分化能力,有必要对C/EBPα靶点miRNA进行筛选、验证,并探索它对ASCs分化的影响。这将为脂肪干细胞的研究及脂肪相关疾病的治疗奠定理论基础。研究内容及方法1.以hASCs成脂分化中的关键基因C/EBPCα为靶点,利用miRNA靶基因预测软件(TargetScan、miRanda、miRDB、RNA22、PicTar),通过结合位点的自由能和二级结构的稳定性等评分标准,筛选出能调控C/EBPα的靶点miRNA。2.提取hASCs成脂分化第0天、1天、3天和6天的RNA,结合实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测hASCs成脂分化中miRNAs的表达,筛选出与成脂分化负相关的miRNA。3.利用 PCR 技术扩增出 C/EBPα 3’ UTR 片段,突变 C/EBPα 3’ UTR 上 hsa-miR-326靶位点序列,并将它们亚克隆至双荧光素酶报告基因载体,构建psiCheck2[C/EBPα 3’UTR-WT/MUT]载体。把靶点miRNA和野生型、突变型靶位点载体,共转染至293T细胞系,以验证靶点miRNA对转录因子C/EBPαα的调控作用。4.利用慢病毒载体(购于上海吉凯公司)过表达或干扰hASCs的miR-326,通过油红0染色、qRT-PCR及Western Blot检测转染后的hASCs成脂分化中C/EBPαα的表达水平的变化及对成脂分化的影响。研究结果1.利用多种靶基因预测软件预测C/EBPα的潜在靶点miRNA。初步结果显示,分别能预测出424、104、49、1194、9个miRNAs,能被5种软件同时预测的miRNAs有1个,即hsα-miR-326。进一步分析发现C/EBPα 3’UTR上存在两个hsa-miR-326靶位点。2.在 hASCs 成脂第 1、3、6d 对 C/EBPα 3’UTR 上的 miRNAs 做 qRT-PCR 行定量分析。随着成脂分化时间增加,其中miR-326的表达逐渐下降。成脂1d,miR-326的表达量是GM的0.5462±0.0655倍(P<0.0001);成脂3d,miR-326的表达量是 GM 的 0.4376±0.11417 倍(P<0.0001);成脂 6d,miR-326 的表达量是 GM的 0.2416±0.046 倍(P<0.0001)。而 miR-92a、miR-301b 和 miR-548h-5p 的表达变化不明显。3.成功构建了 psiCheck2[C/EBPα3’UTR-WT/MUT]载体,把构建成功的报告基因载体和miR-326过表达/干涉质粒,共同转入HEK293T细胞中。共转染miR-326过表达质粒和野生型3’UTR时,荧光素酶活性显著下调(P<0.0001),而共转染miR-326过表达质粒和突变型3’UTR,其荧光素酶活性并没有显著改变。共转染miR-326干扰质粒后,双荧光素酶的活性并没有显著改变。4.慢病毒转染hASCs,过表达载体病毒成功上调miR-326,但是干扰载体病毒没有达到下调miR-326的表达的目的。转染后的干细胞进行成脂分化处理,油红0染色、qRT-PCR及Western Blot均表明过表达miR-326后,成脂分化能力下降,其差异有统计学意义;而干扰miR-326(anti-miR-326)组并没有达到上调hASCs成脂分化能力的目的。结论1.通过生物信息学预测的方法,筛选出成脂分化的关键因子C/EBP α的miRNAs,并随着成脂分化,miR-326的表达量下降,提示了 miR-326与人脂肪干细胞成脂分化密切相关。2.分别构建了 C/EBP α野生型和靶位点突变型的3’ UTR,利用双荧光素酶报告基因实验进一步验证了 miR-326可与C/EBP α 3’ UTR结合。3.在干细胞中上调或下调miR-326的表达,上调后的干细胞成脂分化能力减弱,C/EBPα的蛋白量表达下降,更加验证了 miR-326与C/EBPα3’ UTR结合,使其翻译受阻,表达量下降,进而抑制了干细胞的成脂分化。