LncRNA Malat1-miRNA-195-Smad7信号轴在肝纤维化中的作用及机制研究

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研究背景:在肝纤维化的发生发展过程中,致病因素持续作用于肝脏导致慢性肝损伤是其进展的重要原因。肝纤维化的核心环节在于肝星状细胞的活化和细胞外基质的大量积累,肝组织产生对炎症损伤的创伤反应和修复应答,这种损伤-再修复的机制最终能够导致肝纤维化进展成为肝硬化和肝癌等疾病。因此,阻止肝星状细胞的增殖与活化,抑制活化的肝星状细胞分泌细胞外基质,成为了减轻和治疗肝纤维化的重要方法。随着生物化学与分子生物学等学科的发展,大量研究已经证实通过药物抑制信号通路的激活是肝纤维化治疗的热点,诸如针对TGF-β1/Smads信号通路和其下游细胞信号蛋白的调控,可以有效延缓肝纤维化疾病的进展。已有研究表明,LncRNA Malat1在肝纤维化的患者肝组织和离体纤维化模型肝细胞株中表达上调,其在肝纤维化的发生发展过程中扮演重要角色。此外,有文献证实Mi RNA-195可以通过Smad 7蛋白参与肝脏恶性肿瘤的调控。但是LncRNA Malat1以及miRNA-195和Smad7蛋白是否作为信号轴在肝纤维化的发生发展过程中起作用尚未有研究报道。本课题将针对这一猜想进行深入探讨。目的:探讨LncRNA Malat1-miRNA-195-Smad7信号轴在肝纤维化中的发展机制,为肝纤维化的诊断提供新的分子标志物,为治疗提供新的靶点。方法:取术后肝纤维化患者肝组织(n=12),用q RT-PCR技术检测其肝脏LncRNA Malat1表达情况。养殖24只8-9周龄完全成年的C57BL/6J雄性小鼠,将其随机分成4组,每组6只,分组包括正常对照组、肝纤维化组、肝纤维化+注射慢病毒Malat1基因敲除组、肝纤维化+慢病毒对照组。在第4周末处死小鼠,观察小鼠肝脏组织形态及大小。同时用q RT-PCR技术检测小鼠肝脏及血清中LncRNA Malat1与hsa-miR-195-5p的相对表达含量,采用FISH技术检测小鼠肝脏石蜡切片中Malat1的表达情况,用Western blot技术检测各组Smad7蛋白和纤维化相关蛋白α-SMA、I型胶原的表达。对于人肝星状细胞LX-2细胞株进行培养。对细胞株分成4组,包括正常对照组,沉默LncRNA Malat1组,正常对照+TGF-beta1刺激造模组,沉默LncRNA Malat1+TGF-beta1刺激对照组。通过注射TGF以刺激星状细胞增殖模拟肝纤维化模型,通过细胞转染沉默LncRNA Malat1的表达。检测不同分组的LX-2细胞株中的LncRNA Malat1与Mi RNA-195-5p的表达,Smad7蛋白表达及纤维化相关蛋白α-SMA、I型胶原的表达。结果:1.LncRNA Malat1在肝纤维化患者的肝组织,CCL4造模的肝纤维化C57小鼠,以及纤维化LX-2细胞模型中的表达均增高。2.对于C57BL/6J小鼠模型,取肝组织肉眼可见肝纤维化模型组,肝纤维化+慢病毒对照组肝脏均出现肿大,肝脏表面粗糙,部分肝脏表面出现白色结节。而在肝纤维化+注射慢病毒基因敲除组中肝脏表面白色结节出现较少,粗糙程度较轻,其纤维化程度介于造模组和正常组之间。3.在动物实验中,与正常对照组相比,肝纤维化组及肝纤维化+慢病毒对照组LncRNA Malat1与hsa-miR-195-5p表达均增加,Smad7表达下降,α-SMA和I型胶原表达增加。与正常对照组相比,肝纤维化+注射慢病毒基因敲除组LncRNA Malat1与hsa-miR-195-5p表达均下降,Smad7蛋白表达增加,α-SMA和Col1表达减少,小鼠肝纤维化得到缓解。4.细胞实验中,沉默LncRNA Malat1可以下调miRNA-195表达,上调Smad7蛋白表达,并且纤维化相关蛋白α-SMA和Col1表达减少,在一定程度上缓解肝星状细胞纤维化程度。结论:LncRNA Malat1与其下游调控因子miR-195结合并调控Smad7参与纤维化形成,沉默Malat1可使α-SMA和I型胶原表达下降,缓解肝纤维化。
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