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骨组织工程是一个涉及到多种学科的交叉研究领域,在骨缺损、骨不连等疾病的修复和重建治疗方面它已经展示了良好的发展前景。目前,骨组织工程的研究主要集中于以下三个方面:(1)种子细胞的研究;(2)生物支架材料的研究;(3)工程化骨组织的体外构建。细胞-支架材料复合物的体外构建是骨组织工程中最重要的环节之一。我们实验室有关“个性化骨组织的细胞罐培养及其在动物中的应用研究”课题也主要围绕细胞-支架材料复合物的体外构建进行。本论文选择人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)作为种子细胞。我们验证了hBMSCs在进行孔板培养时的增殖能力、成骨分化和成软骨分化能力,hBMSCs进行成骨分化和成软骨分化后的染色实验、重要生化指标分析和标志基因的蛋白表达检测均表明,成骨和成软骨分化组相较于对照组,在细胞形态、重要生化指标和标志基因的蛋白表达上均发生了显著的变化,呈现出明显的分化趋势,证实了hBMSCs作为种子细胞的可行性。本论文针对四种细胞因子包括促红细胞生成素(EPO)、神经生长因子(NGF)、胰岛素类生长因子-1(IGF-1)和β-干扰素(IFN-β)进行诱导hBMSCs成软骨分化的检测,筛选出能促进hBMSCs成软骨分化的新细胞因子。结果发现完全培养基中加入100ng/mL IFN-β,h BMSCs在形态上发生显著变化,alcain blue染色和GAG总含量检测均证实IFN-β具有诱导hBMSCs成软骨分化的能力。IFN-β和TGF-β3的不同组合实验结果表明,IFN-β促进hBMSCs成软骨分化的能力要强于传统成软骨诱导因子TGF-β3,而且两者一起作用的效果要远远好于单独作用。不同浓度的IFN-β实验结果表明,100ng/m L IFN-β和10ng/m L TGF-β3组合促进hBMSCs成软骨分化的效果更好。本论文选择聚乳酸-羟基乙酸/磷酸三钙(PLGA/TCP)材料作为hBMSCs增殖和分化的支架材料,我们首先验证了PLGA/TCP材料是否具有良好的生物相容性。扫描电镜结果展示hBMSCs充分利用材料的多孔特性,在材料上的增殖能力明显好于2D的孔板培养。MTT检测和ALP酶活性检测结果表明,PLGA/TCP材料具有良好的生物相容性,不仅能支持hBMSCs的粘附和生长,还能促进hBMSCs的增殖和分化。我们接着检测了PLGA/TCP材料在动物体内的生物安全性,热原实验、溶血实验、急性全身毒性实验、皮内刺激反应实验、皮下植入实验等实验结果均表明PLGA/TCP材料在动物体内的生物安全性良好,且降解速度适宜,降解产物无害,可以作为hBMSCs的载体支架植入体内。本论文设计的饲喂-培养灌流细胞罐系统同时处理多个hBMSCs和PLGA/TCP支架复合物。支架被固定在培养罐中,饲喂罐通过实时的监控和控制系统为细胞提供含有充足的营养和氧气、具有适宜pH值和温度的培养基。我们分析了hBMSCs和PLGA/TCP支架复合物在饲喂-培养灌流细胞罐系统中进行动态培养时的成骨分化和成软骨分化水平。扫描电镜、重要生化指标、qRT-PCR、western blotting等检测结果表明在细胞罐的动态培养下,hBMSCs在PLGA/TCP支架上不仅增殖迅速,而且其成骨分化水平比静态培养时更高,各项数据之间比较都具有明显差异,其成软骨分化水平和静态培养时相当。我们依据以上数据验证了饲喂-培养灌流细胞罐系统应用于骨组织工程的可行性。我们的研究证明了利用hBMSCs作为种子细胞,PLGA/TCP材料作为细胞支架,由具有组成结构优势的饲喂-培养灌流细胞罐系统对hBMSCs和PLGA/TCP支架复合物进行动态培养,从而大规模进行骨组织工程所需要细胞-支架材料复合物的体外构建具有非常高的可行性。而IFN-β促进间充质干细胞成软骨分化能力的发现为骨组织工程指出了新的研究方向。