论文部分内容阅读
桑黄(Phellinuslinteus)是近年来引起研究者广泛关注的一种珍稀食药用真菌，所含有的生物活性成分如多糖、蛋白和多酚等在抗肿瘤、调节免疫力、降血糖等方面具有明显的效果。本文拟采用原生质体诱变技术，对野生桑黄菌PLW-Ⅱ进行钴-60辐照处理，筛选生长性能优良的菌株;进而对其发酵培养基组成和发酵条件进行系统优化;最后通过在25L发酵罐上开展放大试验，建立桑黄发酵动力学模型。
主要研究内容和所得结论如下:
(1)采用原生质体钴-60辐照诱变方法，筛选桑黄发酵高产菌株。首先采用18SrDNA序列同源性分析法，经形态学和分子遗传学研究，鉴定野生桑黄菌株PLW-Ⅱ为裂蹄木层孔菌（Phellinuslintenus）。采用酶解法制备桑黄原生质体，再用钴-60射线诱变原生质体，计算诱变致死率，确定钴-60诱变剂量为100Gy，此时诱变致死率为75％。按照100Gy的诱变剂量进行诱变，筛选出平板中生长速度较快的10株变异株，经液体摇瓶发酵试验，筛选3株变异株JU7、JU8和JU10，其菌丝体产量分别为9.9g/L、10.3g/L和9.5g/L，比出发菌株分别高出3.1g/L、3.5g/L和2.7g/L。考察3株变异菌株的遗传稳定性，平板中连续传代培养5次，同时进行摇瓶发酵试验，测定液体发酵中菌丝生物量。实验表明，5次传代培养中，JU8的菌体生物量保持在10.0～10.4g/L，遗传稳定性较好，因此选择JU8作为后续发酵试验菌株。
(2)以菌体量为指标，利用单因素实验和Box-Behnken3×3设计优化桑黄PhellinuslinteusJU8深层发酵培养基组成。响应面分析结果表明，各因素对桑黄菌丝体量均存在显著的相关性;优化后的发酵培养基组成为:葡萄糖35.85g/L，麸皮16.52g/L，酵母膏3g/L，KH2PO41.0g/L，在此条件下，菌丝生物量可达16.26g/L。最适培养条件为:培养温度30℃，摇床转速160r/min，接种量15％，装液量100mL/250mL，初始pH5.5，摇瓶培养8天。25L发酵罐放大试验结果表明，在发酵体积18L，温度30℃，通气量0.8vvmin，搅拌速度160r/min的条件下，发酵培养8d，菌体生物量可达18.8±1.21g/L。
(3)在25L发酵罐上进行分批发酵试验，通过测定发酵过程中的桑黄菌体生物量、胞外多糖产量和残糖消耗量，建立了桑黄PhellinuslinteusJU8分批发酵动力学模型。根据菌株在25L发酵罐分批发酵过程中所表现出来的菌体生长、产物生成和底物消耗规律，确定桑黄胞外多糖合成类型属于细胞生长部分偶联型。因此选择Logistic方程和Luedeking-Piret方程分别描述菌体生长动力学、产物生成动力学和底物消耗动力学规律;利用Origin8.0软件对其实验数据进行非线性拟合，得到相关动力学模型参数，从而获得相关发酵动力学模型。结果显示，桑黄分批发酵动力学模型拟合效果较好。