细胞抗病毒固有免疫是宿主抵御病毒感染的第一道屏障,具有普遍性、多样性、反应快速等特点。病毒感染宿主后,存在于宿主体内的模式识别受体能够识别病毒所产生的病原相关分子模式,从而激活模式识别受体介导的Ⅰ型干扰素的表达,Ⅰ型干扰素分泌到细胞外与细胞表面的干扰素受体结合,并通过JAK-STAT信号通路诱导大量抗病毒基因表达,这些基因表达产物具有抑制病毒复制和诱导被感染细胞凋亡等功能,从而使得宿主抵抗病毒感染和复制。STING是定位于内质网上的膜蛋白分子。STING对RNA病毒和DNA病毒诱导的Ⅰ型干扰素表达及细胞抗病毒反应至关重要。泛素化修饰在病毒诱导Ⅰ型干扰素产生过程中的起着重要的作用,有文献证明病毒感染细胞能引起STING发生K63泛素化修饰,并且之前的研究鉴定出了 E3连接酶TRIM32和TRIM56均能增强STING的K63泛素化,进而增强病毒诱导的Ⅰ型干扰素的表达。接下来,我们利用去泛素化酶的表达文库,通过STING激活IFNβ报告基因的实验方法,筛选是否存在去泛素化酶参与STING激活的IFNβ过程。在本项研究工作中,我们鉴定出去泛素化酶USP21,它能够结合并去泛素化STING,也能显著的抑制STING介导的Ⅰ型干扰素信号通路的激活。过量表达USP21可以抑制STING介导的Ⅰ型干扰素的表达以及细胞的抗病毒能力,而下调USP21的表达则有相反的影响。野生型USP21而非USP21失活突变体(USP21 C221A)能够去泛素化STING,同时我们还发现USP21失活突变体不能阻断STING介导的抗病毒反应。HSV基因组复制实验证明,在利用USP21-RNAi下调USP21的表达的L929细胞以及在USP21基因敲除的小鼠MEF细胞中,细胞的抗病毒作用均有所增强。这些实验结果一致表明,USP21依赖去泛素化酶活性负调节STING介导的细胞抗病毒免疫反应。在机制方面,我们利用免疫共沉淀实验发现USP21能够和STING相互作用,体内和体外去泛素化实验证明STING是USP21的直接底物,并且去除TRIM32所促进的STING的K63位泛素化修饰。同时,我们发现USP21靶向去泛素化STING蛋白,从而抑制了STING的激活,破坏了 STING与TBK1的相互作用,进而阻碍了 IRF3与STING的结合,抑制了 IRF3的磷酸化、二聚化以及入核。总而言之,具有去泛素化酶活性的USP21能够通过水解STING上发生的K63泛素化修饰,阻碍STING和TBK1的结合,进而影响STING和IRF3的结合,从而负调控细胞抗病毒免疫反应。之前,研究人员发现USP21能够靶向RIG-I从而负调控RNA病毒介导的固有免疫。综上所述,USP21在病毒介导的免疫反应中可能起着至关重要的作用,所以我们构建了USP21活性检测系统,希望通过大规模筛选的方式,找到特异性针对USP21的化合物,从而开发出新的靶向USP21的抗病毒药物。Nanoluc作为一种新型高灵敏度报告基因,相对与之前应用的荧光素酶报告基因Firefly和Renilla灵敏度高大约150倍,并且相对与Firefly和Renilla报告基因,Nanoluc有着蛋白结构小,发光稳定的优点,表明了Nanoluc可以作为一个高通量检测去泛素化酶活性的报告基因。基于以上优点,我们构建了 Ub-Nanoluc和Ub-Ub-GS-Nanoluc系统检测USPs和OTULIN的活性,希望筛选出一些靶向调控固有免疫的去泛素化酶的小分子化合物。然而,本项研究不足之处在于目前仅在细胞水平上证明了 USP21对于STING介导的抗病毒信号通路的作用,所以我们需要进一步在USP21基因敲除小鼠上证明其对STING介导的抗DNA病毒固有免疫的重要性。另外,关于USP21抑制剂的筛选,我们目前建立了稳定的报告基因系统,但是抑制剂筛选还处于初步阶段,需要更深一步去筛选抑制效果好的并且在细胞水平以及动物水平有作用的抑制剂。