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目的:1.构建mi R-21抑制剂的慢病毒系统以及PPARA和VHL的荧光素酶报告质粒,验证PPARA和VHL为mi R-21的靶基因并阐述mi R-21通过PPARA和VHL对EGFR信号通路调控的详细分子机制;在体内实验和体外实验中联合mi R-21抑制剂和EGFR单克隆抗体--尼妥珠单克隆抗体治疗胶质瘤,为优化胶质瘤的基因治疗提供新的思路。2.利用生物信息学方法找出可能受lnc RNA HOTAIR调控的信号通路,通过小分子抑制剂阻断以及表达载体构建等方法阐明LSD1复合物和PRC2复合物在lnc RNA HOTAIR对胶质瘤细胞周期进展调控中的分子机制。方法:1.用表达mi R-21抑制剂的慢病毒感染胶质瘤细胞系U87、LN229和U251,Western blot方法检测EGFR、p-EGFR、AKT、p-AKT的表达水平变化;细胞克隆形成实验、细胞流式分析以及transwell实验检测mi R-21对胶质瘤细胞增殖、细胞周期进展、细胞侵袭以及细胞凋亡的影响。2.通过靶点预测找出mi R-21可能的靶点;荧光素酶报告实验验证PPARA和VHL为mi R-21的靶基因;免疫荧光和蛋白质免疫共沉淀揭示β-catenin和PPARα之间的调控网络。3.构建胶质瘤颅内动物模型,研究mi R-21抑制剂和尼妥珠单抗联合应用的体内抑瘤效果。4.生物信息学分析HOTAIR可能调控的下游信号传导通路;利用含lnc RNA HOTAIR干扰序列的慢病毒、EZH2小分子抑制剂DZNep、LSD1小分子抑制剂2-PCPA分别处理胶质瘤细胞U87和LN229,分析它们对胶质瘤细胞周期的影响。5.在敲低HOTAIR的U87和LN229细胞系中分别过表达HOTAIR的3’及5’结构域,验证si RNA HOTAIR引起的细胞周期阻滞能否部分恢复。6.构建颅内原位胶质瘤动物模型,检测HTOAIR siRNA的体内抑瘤效果。结果:1.感染mi R-21抑制剂病毒的胶质瘤细胞中p-EGFR和p-AKT表达明显下调,细胞的增殖受到抑制,细胞周期被阻滞在G1期,细胞凋亡明显增加(p<0.01)。2.Western blot实验和荧光素酶报告实验证实VHL及PPARA为mi R-21的直接作用靶点。3.感染mi R-21抑制剂或转染VHL表达质粒均能降低经典型Wnt/β-catenin信号通路的活性。Western blot和免疫荧光结果提示mi R-21通过靶定PPARα进而上调转录因子AP-1的转录活性调节EGFR/AKT信号通路。4.蛋白质免疫共沉淀结果证明β-catenin和AP-1能形成复合体,且复合体的形成受mi R-21的调控。5.mi R-21抑制剂联合尼妥珠单抗治疗胶质瘤效果优于单药治疗。6.生物信息学结果显示HOTAIR调节的基因主要参与细胞周期的调控。7.EZH2抑制剂DZNep能模拟si RNA HOTAIR的功能,将胶质瘤细胞周期阻滞在G1期。8.HOTAIR敲低的细胞系中过表达其5’结构域能部分的回复受si RNA HOTAIR引起的细胞周期抑制作用。9.胶质瘤颅内模型证实siRNA HOTAIR能抑制胶质瘤的生长。结论:1.mi R-21通过靶定VHL/β-catenin和PPARα/AP-1调节EGFR/AKT信号传导通路。2.EGFR和mi R-21之间存在反馈调节环路。3.体内外研究显示联合尼妥珠单克隆抗体和mi R-21抑制剂治疗胶质瘤优于单药治疗。4.Lnc RNA HOTAIR调控的基因主要参与细胞周期过程;HOTAIR主要通过其5’结构域和PRC2复合物的结合调节胶质瘤细胞周期进展。5.敲低HOTAIR的表达能在体内抑制胶质瘤的恶性增殖。