目的:第三代EGFR-TKI在临床试验中较一代、二代TKI显示了更加惊喜的数据,奥希替尼作为目前唯一获批的三代TKI逐渐在临床上得到广泛认可并顺利赢得四大指南联合推荐一线治疗宝座。然而奥希替尼作为新一代的明星靶向药物,终将面临耐药问题。明确耐药机制,并探索耐药后潜在的治疗策略成为重要的研究方向。本课题拟通过体外诱导建立奥希替尼耐药细胞株H1975/OR,利用二代测序技术找到可能导致奥希替尼获得性耐药的关键基因,探讨奥希替尼获得性耐药的分子机制。以期为EGFR-TKI获得性耐药机制研究提供更多体外实验依据,进而为临床耐药后患者找到潜在性的治疗策略。方法:对含有EGFR L858R/T790M双突变的细胞系H1975进行体外低浓度加量递增方法诱导建立第三代EGFR-TKI奥希替尼耐药株H1975/OR。经过细胞毒性实验检测耐药指数明确成功建立耐药株后首先比较亲本细胞与耐药细胞在形态学及生物学特征方面的差异,包括利用CCK8、平板克隆形成明确两株细胞增殖水平差异,利用流式分析仪检测凋亡与细胞周期的差异,利用划痕实验、Transwell实验明确两株细胞迁移、侵袭能力的差异。由表型的差异考虑可能发生上皮间质转化。首先利用Real-time PCR及Western Blotting检测亲本细胞与耐药细胞EMT相关分子的mRNA水平、蛋白水平表达情况,同时采用RNA干扰技术对耐药细胞株的上皮间质转化关键的转录调控因子Snail进行Knockdown,确认干扰效率后明确下调Snail后上皮间质转化相关分子的改变,同时再次明确下调Snail后耐药株对奥希替尼的敏感性改变及迁移侵袭能力的改变。对亲本细胞与耐药细胞株中与EMT相关的明星通路的活化水平进行初步检测。最后分别送检两株细胞进行基因水平的二代测序,对测序结果进行质控,利用COSMIC、ICGC、CCLE数据库对位点突变信息进行查找分析,同时利用SIFT、Polyphen2、Mutation Assessor在线分析软件对耐药株中发生单核苷酸变异的新发差异突变进行有害性预测评估,最后将差异基因进行KEGG通路富集分析,以期找到可能导致奥希替尼耐药的突变基因。结果:在第一部分中,本课题首先验证药物与实验所用细胞系均符合课题实验要求的前提下,采用药物低浓度梯度递增法历时5个月成功诱导建立奥希替尼耐药细胞株H1975/OR,其IC50约4.5μmol/L,耐药指数为391.3。在形态学上,耐药细胞株H1975/OR表现细胞性状不规则,失去上皮样细胞形态,多呈梭型,且胞浆中多由圆形空泡,细胞间隙增大;在生物学特征上,耐药细胞株H1975/OR较亲本细胞具有增殖缓慢、倍增时间延长,凋亡减少、细胞周期G2/M阻滞、高迁移、高侵袭等特性。根据第一部分结果我们推测EMT在奥希替尼获得性耐药过程中具有重要作用,因此在第二部分通过对亲本细胞H1975与耐药细胞H1975/OR EMT相关分子在mRNA水平、蛋白水平检测分析,证实上皮表型分子E-cadherin表达下调,间质表型分子N-cadherin、Vimentin表达升高,促使EMT的关键转录因子Snail、TWIST1表达升高,并且与迁移侵袭能力相关的MMP-2/9在耐药株中高表达。当我们下调Snail后发现EMT逆转现象;同时,在EMT逆转后耐药细胞株H1975/OR对奥希替尼的敏感性明显恢复,且迁移能力下降。充分证实了EMT在奥希替尼耐药中的作用。另外,我们对与EMT相关的部分明星通路活化进行初步筛查,发现IGF1R、Wnt/β-catenin、NF-κB信号通路在耐药细胞H1975/OR中异常激活,或许参与TKI获得性耐药的信号转导。第三部分我们采用二代测序技术对亲本细胞H1975和耐药细胞H1975/OR在基因水平上进行一项大Panel基因突变检测,下机质控达标合格后对测序结果进行分析。H1975共检出54个基因突变位点,H1975/OR细胞株共检出61个突变位点,其中单核苷酸变异均是最常见的变异类型。对比两株细胞差异突变后发现,突变频率增高位点有4个,频率降低的位点有3个,新发突变位点有13个,突变消失位点有6个。测序结果经数据库及文献查找,所有突变位点信息均未有记录及报道,并且未发现目前明确已知的奥希替尼耐药机制,例如EGFR C797S突变、MET扩增、HER2扩增等。在对比差异基因后找到13例耐药株新发基因突变位点,其中10例属于单核苷酸变异,1例属于插入突变,2例属于缺失突变。进一步利用多种数据库对相应突变位点进行序列、结构、编码蛋白有害性、通路富集等预测评估。结论:体外成功诱导建立奥希替尼获得性耐药细胞株H1975/OR,推测上皮间质转化参与了奥希替尼获得性耐药过程,同时二代测序并未发现明确已知的耐药机制及相关基因位点突变。