背景（1）遗传性共济失调根据其遗传模式分为常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传、X连锁遗传和线粒体遗传。常染色体隐性遗传性小脑共济失调（ARCA）属于一种具有遗传异质性的神经退行性疾病。主要包括Friedreich共济失调、共济失调毛细血管扩张症、维生素E缺乏性共济失调、Charlevoix-Saguenay常染色体隐性痉挛性共济失调（ARSACS）、脂蛋白缺乏症以及1型和2型动眼神经失用性共济失调。（2）遗传性共济失调具有临床及遗传异质性,属于进展性神经退行性疾病的一种,可引起共济失调步态、构音障碍及其他神经系统体征,包括锥体系体征、锥体外系体征、眼球运动障碍及认知功能障碍等。致病机制中最常见的原因为三核苷酸CAG重复序列扩增,可引起细胞内聚集相应蛋白编码的多聚谷氨酰胺链;第二类常见原因为非编码核苷酸序列扩增,此类包括20余种不同致病基因。即便如此,仍有40%的遗传性共济失调个体病因多样化、原因不明确。因此,加强遗传性共济失调病因学及神经生物学研究,有助于发现治疗此类疾病的药物新靶标,并对提高人类生活质量和健康水平有重要意义。目的（1）本研究旨在揭示Ankfy1突变对小鼠共济失调行为学的影响,探索共济失调发病的新机制。（2）通过研究Ankfy1对Purkinje细胞的功能调节,揭示Purkinje细胞退行性改变在共济失调发病途径中的作用。（3）本研究为探索Purkinje细胞丢失的机制研究,为共济失调新药物研发提供理论依据。方法（1）Ankfy1在C67/B6野生型小鼠中枢神经系统（CNS）的表达:利用原位杂交方法检测Ankfy1 mRNA在不同时间点野生型小鼠CNS的表达特点;利用RT-qPCR方法检测Ankfy1在成年野生型小鼠不同组织器官内的表达;利用免疫荧光方法检测Ankfy1在小脑Purkinje细胞内的表达特点;利用western blot方法检测Ankfy1在成年野生型小鼠不同组织器官内的蛋白表达并量化分析蛋白表达量。（2）动物模型制作及行为学分析:利用基因捕获技术制作转基因小鼠动物模型;利用PCR方法进行小鼠基因型鉴定;利用western blot方法及RT-qPCR方法分别检测Ankfy1/+小鼠小脑内目的基因蛋白及mRNA的表达量;利用转棒实验、步态印迹实验分析小鼠行为学改变。（3）Ankfy1/+小鼠组织病理学改变:利用免疫荧光方法检测小鼠小脑组织Ankfy1及Calbindin-28k的表达特点;利用H&E染色小脑组织,分析Purkinje细胞数量改变情况;利用免疫荧光方法检测野生型（WT）和Ankfy1/+小鼠的小脑、黑质及前庭神经核胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达;利用依莱铬氰染色小脑、脊髓及胼胝体的髓鞘组织,并量化分析实验组及对照组胼胝体厚度;利用RT-qPCR方法检测MBP mRNA及RORa mRNA的表达差异;利用RT-qPCR方法检测P7、P14、P21及P30小鼠的小脑中BDNF、MANF和NT-3的mRNA表达水平。（4）体外培养Purkinje细胞进行形态学分析:体外培养Purkinje细胞,利用免疫荧光染色方法染色细胞;利用Sholl分析软件、Bonfire程序、ImageJ和NeuronStudio的NeuronJ插件及MATLAB（MathWorks）软件进行Purkinje细胞形态学分析。（5）Ankfy1下调影响凋亡的检测:利用TUNEL方法检测Ankfy1/+小鼠及WT小鼠小脑组织;利用western blot方法检测Ankfy1/+小鼠小脑凋亡相关蛋白表达;培养A172、SH-SY5Y细胞,利用Ankfy1 shRNA干扰细胞内目的基因的表达;利用western blot方法检测Ankfy1下调后,A172细胞内凋亡相关蛋白表达;利用western blot方法检测Ankfy1下调后,A172细胞内Akt及p-Akt的表达。结果（1）通过原位杂交实验研究发现,Ankfy1mRNA主要在脊髓、海马及小脑内特异性表达。体外培养Purkinje细胞,利用免疫荧光进行Ankfy1与Calbindin荧光双染,发现Ankfy1特异性表达于Purkinje细胞的胞体、树突及轴突,且主要表达于Purkinje细胞胞体的周边。利用基因捕获技术获得Ankfy1/+转基因小鼠,但未发现全基因突变小鼠,且杂合型小鼠与野生型小鼠数量比例符合子孟德尔定律,说明Ankfy1全基因敲除小鼠具有胚胎致死性。利用RT-qPCR及western blot检测方法检测Ankfy1表达,发现Ankfy1/+转基因小鼠目的基因的mRNA及蛋白表达量均降低。Ankfy1/+转基因小鼠疾病早期出现运动协调功能异常及肌张力障碍表型。（2）Ankfy1/+小鼠从60天开始小脑Purkinje细胞出现严重丢失,且转基因小鼠的共济失调步态异常表型出现早期,并未出现Purkinje细胞的大量丢失。Ankfy1/+小鼠胶质化表现,可能为Purjinje细胞丢失的一种保护机制。Ankfy1/+小鼠与WT小鼠髓鞘组织无差异,MBP表达量差异无统计学意义,说明Ankfy1/+小鼠未出现脱髓鞘改变。Ankfy1的突变影响小鼠中的BDNF、NT-3及MANF表达;Ankfy1的表达降低减少MANF及BDNF在ARSACS疾病动物模型中的表达,二者可能参与维持Purkinje细胞存活。（3）Ankfy1/+转基因小鼠Purkinje细胞出现轴突肿胀,较WT小鼠细胞更易受损。在距离Purkinje细胞胞体相同位置上,Ankfy1/+转基因小鼠Purkinje细胞树突分枝数量更少。Ankfy1/+小鼠单个Purkinje细胞树突总长度及总数量、树突总分枝点数量及总树突终末点数量明显低于WT小鼠的Purkinje细胞。Ankfy1/+小鼠及WT小鼠Purkinje细胞树突根部长度之间的差异不明显,而树突中间部分及终末部分明显少于WT小鼠。（4）Ankfy1/+转基因小鼠Purkinje细胞发生凋亡,且caspase 3及cleaved caspase 3表达升高。下调A172细胞内的Ankfy1水平后,细胞发生凋亡,且cleaved caspase 3及caspase 8的表达水平升高。下调A172细胞及SH-SY5Y细胞内的Ankfy1对细胞增殖没有影响。结论（1）Ankfy1在小鼠体内广泛表达,在CNS主要表达于脊髓、海马及小脑,且特异性表达于小脑Purkinje细胞内。（2）下调小鼠体内的Ankfy1水平后,小鼠出现运动协调障碍表型。（3）Ankfy1/+小鼠异常表型与Purkinje细胞丢失相关。（4）体外培养Ankfy1/+小鼠Purkinje细胞,出现树突长度及分枝数量的减少,以及轴突肿胀,说明在Purkinje细胞丢失前已经发生了形态学改变。（5）Purkinje细胞的丢失与凋亡信号通路相关。（6）Ankfy1/+小鼠体内神经营养因子表达异常,且由PI3K/Akt信号通路参与调控。