【摘 要】
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目的:绵羊支原体肺炎是一种混合性感染的羊类传染病,其主要病原为绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae,MO）,该病的传播可以造成羊类养殖场的经济危机。本研究以绵羊重组SPLUNC1蛋白（rSPLUNC1）为研究对象,探究其体外抗MO的功能。首先,比较不同品种绵羊各组织器官SPLUNC1基因表达水平的差异;研究rSPLUNC1对体外培养的MO代谢的影响、对MO黏附山羊气管上
【基金项目】
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国家自然科学基金资助项目—《盘羊及其杂交羊SPLUNC1特性研究及抗肺炎支原体差异表达基因的筛选》（NO:31460686）；
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目的:绵羊支原体肺炎是一种混合性感染的羊类传染病,其主要病原为绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae,MO）,该病的传播可以造成羊类养殖场的经济危机。本研究以绵羊重组SPLUNC1蛋白（rSPLUNC1）为研究对象,探究其体外抗MO的功能。首先,比较不同品种绵羊各组织器官SPLUNC1基因表达水平的差异;研究rSPLUNC1对体外培养的MO代谢的影响、对MO黏附山羊气管上皮细胞的影响、对嗜酸性粒细胞（EOS）杀伤MO作用的影响,以及α1-抗胰蛋白酶调节rSPLUNC1抗MO的影响,分析并验证该蛋白在抗MO感染中所起的作用,为防治绵羊支原体肺炎提供新材料。方法:（1）SPLUNC1基因的表达及蛋白纯化:利用本团队保存的绵羊GS115/p PIC9K-SPLUNC1巴斯德毕赤酵母阳性克隆株,经诱导、纯化后,SDS-PAGE电泳验证目的蛋白。（2）不同品种绵羊SPLUNC1基因序列比较及定量分析:分别克隆阿勒泰羊与多胎萨福克羊SPLUNC1基因c DNA全长,对比序列差异,Trizol法提取两种羊9种组织器官RNA,反转录合成c DNA,real-time PCR法检测两种羊各组织器官SPLUNC1的m RNA拷贝数。（3）rSPLUNC1对MO代谢的影响:在MO培养液内加入梯度浓度（10μg/m L,20μg/m L,40μg/m L）的rSPLUNC1共培养,分别在第1 d、3 d、5 d、7 d收集待检液,使用酸化法在550nm下检测待检液的吸光值。（4）rSPLUNC1对MO黏附细胞的影响:以兔抗MO的抗体为一抗,经FITC标记后的山羊抗兔Ig G为二抗,利用间接免疫荧光法检测梯度浓度（10μg/m L,20μg/m L,40μg/m L）的rSPLUNC1对MO黏附山羊气管上皮细胞荧光强度的变化。（5）rSPLUNC1介导EOS杀伤MO的影响:采用不连续密度梯度离心法分离绵羊外周血嗜酸性粒细胞,感染10~6CCU/m L MO后加入梯度浓度（10μg/m L,20μg/m L,40μg/m L）的rSPLUNC1共培养,再转入PPLO平板内培养7d,菌落计数法统计结果,计算各组杀伤率。（6）α1-抗胰蛋白酶调节SPLUNC1蛋白抗MO的影响:在分离的绵羊中性粒细胞内添加10~6CCU/m L MO刺激释放中性粒细胞蛋白酶（NE）,利用底物显色法检测在rSPLUNC1特定浓度（10μg/m L）下,加入不同浓度的α1-抗胰蛋白酶（10μg/m L、20μg/m L、40μg/m L）,检测NE活性的变化,同时利用real-time PCR法检测MO 16s rRNA的拷贝数。结果:（1）甲醇诱导72h后,经SDS-PAGE电泳检测在25.53 k Da处出现目的条带,纯化后无杂蛋白。（2）阿勒泰羊和多胎萨福克羊SPLUNC1基因c DNA全长均为768 bp,核苷酸序列相似性达99.87%,阿勒泰羊9种组织器官SPLUNC1 m RNA表达量均显著高于多胎萨福克羊（p<0.05）。（3）检测培养液OD550nm处吸光值,结果发现:随着蛋白浓度的升高,OD550值逐渐下降,MO代谢率不断降低。1d时,中、高浓度组与对照组相比,MO代谢率依次减少了13.23%、19.13%（p<0.05）,3d时,低、中、高组与对照组相比,MO代谢率均出现显著差异（p<0.05）,7d时,10～40μg/m L rSPLUNC1浓度范围内MO代谢率分别降低了11.20%、24.51%、35.86%（p<0.05）。（4）间接免疫荧光显示:10μg/m L rSPLUNC1作用山羊气管上皮细胞后,产生大量绿色荧光,随着蛋白浓度的增加,荧光逐渐减少,荧光强度逐渐减弱,40μg/ml rSPLUNC1作用细胞后产生的荧光最少,强度最弱。（5）中、高rSPLUNC1浓度组与对照组相比杀伤率分别降低了9.2%、17.7%（p<0.05）。（6）检测NE活性,结果发现随着α1-AT浓度的增加,NE的活性不断降低,呈α1-AT浓度依赖型关系,中、高浓度的α1-AT与对照组相比NE活性依次降低了38.58%、71.18%（p<0.05）;检测MO 16s rRNA表达量,与对照组相比,10～40μg/m Lα1-AT能不同程度的降低MO 16s rRNA的拷贝数,且分别降低了34.2%、82.6%、97.3%（p<0.05）。结论:（1）绵羊rSPLUNC1表达成功,且纯化效果良好.（2）绵羊的SPLUNC1基因的分布具有组织器官特异性,两品种羊气管中的SPLUNC1 m RNA表达量最高。（3）rSPLUNC1可以抑制MO的代谢,呈浓度依赖型效应。（4）不同浓度的rSPLUNC1对MO黏附山羊气管上皮细胞均有抑制作用,其中高浓度的rSPLUNC1抑制效果最明显。（5）rSPLUNC1可以抑制EOS对MO的杀伤,呈浓度依赖型效应。（6）α1-AT对MO的调节作用是通过SPLUNC1介导的。
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