沙柳SpsDREB4、SpsDREB8基因克隆及表达分析

来源 :内蒙古农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:dzf2006
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沙柳(Salix psammophila)作为我国西北地区固沙造林的主要树种之一,其维持着沙地生态系统的稳定性。沙柳拥有良好的抗逆性,研究其抗逆相关遗传机制有利于探索沙柳的潜在价值,同时可以利用基因工程技术为培育高效抗性园林植物开辟新的道路。因此,本论文将沙柳作为主要研究对象,研究其具有调控抗逆功能的AP2家族DREB亚家族基因。本研究由沙柳克隆获得SpsDREB4和SpsDREB8基因,利用软件对生物信息进行分析、不同组织表达特异性分析、非生物胁迫表达分析及基因的超量表达载体构建与转化。主要研究结果如下:1.根据植物中DREB基因DNA结合域保守区设计简并引物,提取沙柳全株RNA,反转录获得c DNA,利用RT-PCR扩增获得2个DREB基因CDS序列,序列大小分别为1368bp和864bp,分别编码455和287个氨基酸,命名为SpsDREB4和SpsDREB8基因,系统进化树进一步表明克隆获得的2个基因为DREB A-2组基因。2.生物信息学分析表明:SpsDREB4蛋白分子量为50021.41Da,理论等电点为5.57;SpsDREB8蛋白分子量为31615.84Da,理论等电点为5.21;SpsDREB4和SpsDREB8蛋白二级结构预测均包括α螺旋、延伸链和无规则卷曲,且都属于亲水性蛋白,均无信号肽,无跨膜结构;三级结构显示均含有1个α螺旋和3个β-折叠,其中第二个β-折叠的第14位缬氨酸和19位谷氨酸非常保守。3.利用定量PCR技术分析SpsDREB4和SpsDREB8基因在沙柳中组织特异性表达情况,结果表明,SpsDREB4基因在叶中的表达量最高,嫩茎、根、花的表达量依次降低,茎尖的表达量最低;SpsDREB8基因在嫩茎的表达量最高,叶、花、茎尖的表达量依次降低,根的表达量最低。4.通过非生物胁迫模拟实验,利用定量PCR技术分析了SpsDREB4和SpsDREB8基因在不同胁迫条件下的表达量,结果表明,SpsDREB4基因在非生物胁迫中的表达量微弱,而SpsDREB8基因的表达受干旱、高盐、低温和高温等非生物胁迫的诱导。5.以基因组DNA为模板,扩增获得SpsDREB4和SpsDREB8基因的基因组序列,扩增产物经序列分析表明,SpsDREB4和SpsDREB8基因均无内含子。6.通过Gateway同源置换技术,成功构建植物表达载体PMDC32::SpsDREB4和PMDC32::SpsDREB8,将其利用叶盘法转化河北杨。上述研究结果表明,本研究克隆获得的SpsDREB4和SpsDREB8基因隶属于DREB A-2组,基因组基因扩增表明均无内含子,组织特异性及逆境表达分析表明,两个基因在沙柳的不同组织部位表达不同,对于逆境胁迫响应也不同。本研究为进一步探索木本植物中DREB基因生物信息学及功能研究奠定基础,为利用分子育种技术培育抗性园林植物提供指导。
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