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目的:检测外源性胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)促进大鼠C6胶质瘤细胞增殖的最佳时效和量效点;研究GDNF对胶质瘤细胞周期的影响,并探讨其具体的分子机制,从而为胶质瘤的治疗提供新的靶点。 方法:1、将体外培养的C6细胞分为空白对照组、溶剂对照组和实验组(GDNF浓度分别为10、30、50、70、90μg/L,作用时间分别为12、24、48、72h),用噻唑兰(MTT)比色法检测GDNF促C6细胞增殖的最佳时效及量效点。 2、用流式细胞技术(FCM)检测GDNF对C6细胞周期变化的影响,及加药后增殖细胞核抗原PCNA和KI-67表达的变化。 3、用全基因表达谱检测在GDNF作用0h,6h,12h下,C6细胞中表达有显著差异(倍数≥1.5,p≤0.05)的基因,并对这些差异基因进行实时定量(RT)-PCR验证。 结果:1、浓度在50μg/L以上的GDNF作用24 h后,C6细胞增殖水平升高,在48 h时达到高峰而后趋于平稳或呈下降趋势,与对照组比差异有统计学意义。其中,70μg/L GDNF作用48 h后,MTT检测显示C6细胞的增殖率明显高于其他实验组; 2、流式细胞技术检测数据显示S期百分比、PCNA及KI-67的表达均较对照组有显著的升高; 3、全基因表达谱结果显示,在GDNF分别作用6h,12h后,共有163个基因表达差异显著,其中124个基因表达上调,39个表达下调,65个未知基因。Pathway分析发现这些差异基因参与了细胞膜表面硫酸盐肝素的生物合成,细胞的粘附连接,癌症的转录失活,JAK-STAT信号通路等。GO分析表明这些差异基因抑制了凋亡相关基因caspase-3,p21,p27的表达,上调Bcl-2,cyclinD1等基因的表达水平,在DNA的复制,血管生成,突起生长等方面促进胶质瘤细胞的增殖。实时定量(RT) PCR检测11个持续变化基因的mRNA表达水平,结果与表达谱芯片一致。 结论:1、外源性GDNF促进体外培养的大鼠C6胶质瘤细胞增殖的最佳时效及量效作用点为浓度70μg/L、时间48 h,其促增殖的作用点主要在细胞的DNA合成期(S期),该促增殖作用与PCNA和KI-67两种周期蛋白的表达有关; 2、在GDNF作用下,胶质瘤细胞内Cd24,Rxra,S1c7a5,Synpo,Ndst1,Nfic,Netrin1,Socs2,Vcl,Ccdc6,Kdm4a等基因表达上调,它们参与了神经系统的发育,DNA依赖的转录调控,细胞代谢过程的调节等生物学进程,可能通过细胞的粘附连接,硫酸盐肝素的生物学合成,癌症中的转录失活,Jak-STAT信号通路等来发挥其促增殖作用。