研究背景目前,全世界乙型肝炎病毒（HBV）慢性感染人群约2.57亿例,占世界人口的3.5%,其中至少20%的慢性HBV感染者会发展为终末期肝脏疾病,例如肝硬化（LC）或肝细胞癌（HCC）。虽然我国HBV感染的防治工作已取得巨大成就,但形势依然严峻。目前,我国HBV慢性感染者仍约有7000万例,其中慢性乙型肝炎患者（CHB）约2000万~3000万例,这给我国的公共卫生事业带来了极大的负担。HBV是一种基因组为部分松弛环状DNA（rc DNA）的嗜肝性病毒。基因组全长约3.2 kb,含4个部分重叠的开放读码框（ORF）,即前-S/S区（nt2848nt835）、前-C/C区（nt1814nt2548）、P区（nt2307nt1623）和X区（nt1374nt1838）,编码7种蛋白,包括5种结构蛋白:核心蛋白（HBc Ag）、聚合酶蛋白（Polymerase）、乙型肝炎病毒表面大蛋白（LHBs Ag）、乙型肝炎病毒表面中蛋白（MHBs Ag）与乙型肝炎病毒表面小蛋白（SHBs Ag）;2种非结构蛋白:X蛋白（HBx）和e抗原（HBe Ag）。由于HBV病毒复制过程中,逆转录酶对错配碱基缺乏校正机制,同一宿主体内HBV病毒株之间的基因组并非完全一致,即HBV在宿主体内以准种的形式存在。在宿主免疫压力或药物压力作用下,携带适应性突变的HBV准种株被选择并不断复制成为优势病毒群体,例如在拉米夫定（LMV）或阿德福韦（ADV）等抗病毒药物压力作用下,野生型HBV准种群复制被抑制,而携带rtM204V或rtN236T等耐药突变的准种株被选择并不断扩大成为优势病毒群体。HBV突变被报道与病毒耐药、HBV免疫逃逸及疾病进展有关,其中:1)HBV P区（主要为RT区）突变主要与核苷（酸）类似物耐药（NAs）相关;2)HBV前-S/S区突变与HBV的免疫逃逸及HBs Ag检测假阴性相关;3)HBV前-C/C区突变与疾病进展及HBe Ag检测假阴性有关;4)HBV X区突变主要与肝细胞癌的发生发展有关。携带这些突变的HBV准种在不断变化的宿主肝脏微环境下发生适应性扩增,这对感染者的健康造成了极大威胁,同时也在一定程度上增加了HBV抗病毒治疗的难度。人们对HBV基因突变的认识与研究已经较为深入,如研究者通过开发针对其他抗原表位的抗体以避免HBs Ag检测的假阴性;临床上通过检测RT区突变分析NAs耐药的原因;临床医生通过检测前-C/C区突变nt G1896A及HBV核心启动子区突变A1762T/G1764A评估CHB患者发生肝硬化与肝细胞癌的风险等。但是,有关HBV基因突变,笔者发现仍然有一些问题悬而未决:1)对于未经抗病毒治疗的慢性感染者体内的HBV突变情况及其是否存在经典耐药突变,不同研究之间的结果存在分歧;2)一些RT区突变虽不是经典耐药突变,但它们与NAs的长期使用密切相关。这些RT区突变与表型耐药的关系未明,往往被临床忽视;3)目前,HBV RT区准种在抗病毒治疗过程中的演变特点以及前-C/C区准种在疾病进展中的演变特点相继被报道,但是HBV X区准种在HCC发生发展过程中的变化特点报道较少;4)虽然HBV X区及其突变被报道与HCC的发生有关,但是HBV X区突变促进HCC发生的具体机制仍未明确。本课题主要围绕HBV RT区与X区突变,针对上述问题,开展一系列较为详细的研究工作。研究目的1.通过对未经治疗的HBV慢性感染者的HBV RT区的序列的比对与分析,确认未经NAs治疗的慢性HBV感染者体内是否预存经典耐药,并阐明HBV RT区自然变异在RT区各结构域/间域的分布特点及临床意义;2.通过比较接受NAs治疗的CHB患者与未经治疗的HBV慢性感染者的HBV RT区的序列,厘清NAs治疗相关突变的特点,并阐明研究中发现的特定突变rtL229V的体外耐药表型;3.通过体外分离并模拟HBV相关HCC患者肝癌组织与癌旁组织的HBV X区准种,分析与比较肝癌组织与癌旁组织的HBV X区准种的演变特点,并比较两类组织中HBV X区克隆株的突变差异,以期阐明HBV X区准种在HCC发生发展过程中的演变规律;4.本研究前期在HCC患者肝癌组织中发现了新的HBx三联突变T81P/S101P/L123,为了阐明其致癌作用,笔者利用携带HBx-T81P/S101P/L123S的稳转肝癌细胞系,通过细胞周期检测、EDU参入、细胞集落、蛋白免疫印迹等实验,以阐明HBx-T81P/S101P/L123S在HCC发生发展中作用的分子机制。材料和方法1.利用Sanger测序检测493名未经抗病毒治疗的HBV慢性感染者体内的HBV RT区序列,并对其中63名感染者同时进行二代测序;另有3名未经抗病毒治疗的HBV慢性感染者只进行二代测序。2.利用Sanger测序分别检测285名未经抗病毒治疗的感染者与214名接受核苷（酸）类似物治疗的HBV慢性感染者体内的HBV RT区序列。3.使用T-A克隆在体外模拟HBV相关肝细胞癌患者的肝组织内的HBV X区准种,同时使用Sanger测序检测每一个HBV X区克隆的DNA序列。4.利用香农熵公式Sn=-∑i（pi×lnpi）/ln N（i指准种的类型,pi指某一类准种的数量在整个准种群的比例,N指所有病毒株的数量）计算肝组织内的HBV X区准种复杂性;使用软件MEGA 7计算肝组织内的HBV X区准种多样性,包括遗传距离（d）、同义突变数（d S）和非同义突变数（d N）。5.利用生信软件MEGA 7构建肝组织内HBV X区准种的系统进化树,分析HBV X区准种间的同源性及基因型。6.利用在线工具STRUM,计算机模拟WT（野生型）、rtL229V、rtM204V、rtM204V/L229V、x L123S、x S101P/L123S以及x T81P/S101P/L123S的三维空间构象。7.利用在线工具在线软件ENTROPY分析24例HCC患者的术后肝癌组织与癌旁组织内HBV X区突变的香农熵差异。8.利用慢病毒载体构建稳定过表达HBx-WT、HBx-L123S、HBx-L123S/S101P和HBx-T81P/S101P/L123S的Huh 7细胞株。9.利用CCK-8实验、克隆形成实验、细胞周期检测、EDU掺入实验等评估HBx-T81P/S101P/L123S对Huh 7细胞增殖的影响;使用Western blotting实验检测Rb、p Rb及E2F1蛋白水平。10.利用相差显微镜镜下直接观察、EDU-APC/PI双染、细胞凋亡检测、染色体核型检测等评估HBx-T81P/S101P/L123S对Huh 7细胞基因组稳定性的影响;使用Western blotting实验检测ATM和CDT1的蛋白水平。11.利用小干扰RNA敲减骨髓细胞瘤病病毒致癌基因同系物（MYC）的表达,评估MYC对HBx-T81P/S101P/L123S作用的影响。结果1.HBV RT区突变在未经治疗的HBV慢性感染者中的特点1.1.在明确了基因型特异性氨基酸多态性位点的基础上,笔者对427名HBV慢性感染者的HBV RT区的DNA序列进行了比对,发现156名慢性感染者携带有RT区突变,这些突变主要分布在56个氨基酸位点上。其中,36个氨基酸残基位点上的突变导致RT蛋白或S蛋白的抗原表位的改变。1.2.对RT区不同结构域的突变频率分析后发现,突变主要集中在C结构域、E结构域以及C-D间域。其中,慢性携带者的RT区突变频率在C结构域（2.92%）最高;在慢乙肝患者中,突变主要分布在E结构域（1.38%）和C-D间域（1.2%）;在晚期肝脏疾病患者中,尽管不同结构域间突变频率的差异无统计学意义,但C结构域（1.9%）与C-D间域（1.37%）具有相对较高的突变频率;同时,笔者还发现慢性携带者在C结构域上的突变频率明显高于慢乙肝患者（HC vs CHB vs ALD,2.92%vs0.63%vs1.9%）。1.3.比较271名携带RT突变的慢性感染者与156名未携带RT突变的慢性感染者的临床指标发现,携带有RT区突变,尤其是携带有多个RT区突变的未经抗病毒治疗的HBV慢性感染者具有明显更低的HBV DNA载量（未突变者vs单个突变者vs多个突变,6.36±1.45 vs 6.20±1.60 vs 5.57±1.70,单位为log10 IU/m L）、HBs Ag水平（未突变者vs单个突变者vs多个突变,3.63±0.83 vs 2.73±1.48 vs2.05±1.70,单位为log10 IU/m L）以及HBe Ag阳性率（未突变者vs单个突变者vs多个突变,70.48%vs 64.35%vs36.59%）,同时他们的平均年龄明显更大（未突变者vs单个突变者vs多个突变,34.71±12.99岁vs 37.20±13.86岁vs 40.12±12.55岁）,发生S3、S4期肝纤维化的患者比例更高（未突变者vs多个突变,P=0.03）。1.4.笔者使用二代测序结合Sanger测序的方法分析了66名未经抗病毒治疗的HBV慢性感染者的rt201rt335范围内的DNA序列,发现在Sanger测序的检测限上,两种测序方法的结果基本吻合;二代测序在部分HBV慢性感染者体内检测出较低比例的经典原发性耐药突变;二代测序结果还发现rt251、rt266、rt274、rt280、rt283、rt284以及rt286位点上的突变频率随着疾病的进展逐渐升高。2.HBV RT区突变在核苷（酸）类似物治疗的HBV慢性感染者中的特点与作用2.1.在未经NAs治疗的感染者中,频率在基因型间存在差异的突变只有rtL199V与rtL220I/V;接受NAs治疗的CHB患者中,频率在基因型间存在差异的突变为rtA181T/V与rtL220I/V,提示基因型不同对RT突变影响有限。2.2.经典耐药突变rtL180M、rtA181T/V/I、rtM204I/V/L、rtN236T/I以及耐药表型未明确的突变rtL229V/M/F在接受NAs治疗的CHB患者中的突变频率明显高于未经NAs治疗的感染者。2.3.对10例携带rt229氨基酸位点突变的CHB患者的用药情况进行回顾后发现,rt229位点突变与LMV、Ld T和ETV的使用有关,且不少患者发生rt229位点突变的同时还出现了rtM204V/I与rtL180M突变;通过计算机模拟蛋白三维结构发现,rtM204V与rtL229V明显改变了RT蛋白的空间构象。2.4.体外表型实验结果显示,rtL229V明显降低了HBV的复制能力,并且rtL229V对HBV复制的影响大于rtM204V;此外,rtL229V突变赋予了HBV对LMV的耐药性,并且rtM204V与rtL229V突变的同时出现会大大降低了HBV对ETV的敏感性。3.HBV X区准种在HBV相关原发性肝细胞癌中的特点与作用3.1.笔者从复杂性和多样性两个方面对HBV X区准种异质性进行评价,发现肝癌组织与癌旁组织内的HBV X区准种多样性无显著性差异;但是,肝癌组织内HBV X区准种复杂性明显低于癌旁组织（P<0.01）,表明肝癌组织与癌旁组织内HBV X区准种异质性存在差异。3.2.通过构建肝组织HBV X区准种系统进化树,笔者发现肝癌组织内HBV X区准种的演变与癌旁组织内HBV X区准种的演变产生了较为明显的分歧。3.3.通过对肝细胞癌患者进行克隆测序,笔者发现了B与C基因型混合感染的现象;在混合感染的患者中,C基因型HBV病毒株更多地出现在肝癌组织,而B基因型HBV病毒株更多地出现在癌旁组织。3.4.二代测序结果显示,基因型混合感染在人群中普遍存在。其中慢性携带人群中B基因型HBV病毒株比例略大于C基因型;慢乙肝人群中B基因型HBV病毒株比例明显大于C基因型;晚期肝脏疾病人群中C基因型HBV病毒株比例大于B基因型,表明不同基因型的混合比例与疾病进展相关。3.5免疫耐受阶段C基因型HBV DNA的载量明显高于B基因型的载量（P<0.001）,免疫清除阶段B基因型患者的HBV DNA载量稍高于C基因患者,但无统计学意义,晚期肝病阶段C基因型患者的HBV DNA载量稍高于B基因型患者但无统计学意义,表明患者免疫压力对C基因型HBV的影响较大。3.6.通过比较氨基酸位点上的突变频率与香农熵的差异,笔者发现18个氨基酸位点的突变在肝癌组织与癌旁组织间存在显著差异,包括aa4、aa18、aa26、aa30、aa31、aa33、aa48、aa52、aa60、aa81、aa94、aa101、aa102、aa105、aa118、aa123、aa126及aa144;其中,12个位点（aa4、aa26、aa30、aa33、aa52、aa60、aa81、aa101、aa102、aa105、aa123及aa144）在肝癌组织内发生较多的突变,而在癌旁组织内发生突变较多的位点有6个（aa18、aa31、aa48、aa94、aa118及aa126）;此外,笔者在肝癌组织中首次发现了三联突变HBx-T81P/S101P/L123S,并对其进行了三维结构计算机模拟,结果显示,HBx-T81P/S101P/L123S空间构象较野生型HBx发生了明显改变。4.HBx-T81P/S101P/L123S在HCC发生发展中的作用机制研究4.1.细胞集落形成实验显示,Huh 7-Lv T81P/S101P/L123S在体外形成了更多的细胞集落;CCK8实验显示,Huh 7-Lv T81P/S101P/L123S增加的细胞数目明显更多;EDU掺入试验显示,有更多的Huh 7-Lv T81P/S101P/L123S细胞处于DNA的复制阶段;细胞周期检测显示,有更多的Huh 7-Lv T81P/S101P/L123S处于S期;Western blotting实验显示,E2F1与p-Rb的蛋白水平在Huh 7-Lv T81P/S101P/L123S中明显增加。上述结果提示,HBx-T81P/S101P/L123S可促进Huh 7细胞增殖。4.2.通过相差显微镜观察,笔者发现Huh 7-Lv T81P/S101P/L123S中形成了多核巨细胞;使用EDU-APC/PI双染,发现明显更多的Huh 7-Lv T81P/S101P/L123S在G2期形成了大于四倍体的基因组;在基因毒性药物的作用下,有更多的Huh7-Lv TM细胞发生凋亡;Western blotting实验显示,Huh 7-Lv TM细胞中CDT1和ATM的蛋白水平明显增加;染色体核型分析结果显示,Huh 7-Lv TM的核型存在染色体断裂的现象。上述结果提示,HBx-T81P/S101P/L123S可导致Huh 7细胞基因组不稳定。4.3.Western blotting实验显示,Huh 7-Lv TM细胞表达了更多的MYC蛋白。Western blottingt实验、EDU掺入试验、细胞周期检测的结果显示,敲减MYC水平后,Huh 7-Lv TM细胞的增殖水平的下降幅度明显高于其他稳转细胞系。结论1.HBV RT区突变在未经治疗的HBV慢性感染者中的特点通过Sanger测序结合二代测序的方法,证实了未经治疗的HBV慢性感染人群存在低比例的原发性耐药突变;通过分析RT突变对抗原表位的影响以及RT突变与感染者的临床特征的关系,发现免疫压力可能是RT区发生自然变异的主要驱动力之一;同时,笔者分析了不同肝病阶段RT区的自然变异情况,发现RT突变可能参与了肝病进展。2.HBV RT区突变在核苷（酸）类似物治疗的HBV慢性感染者中的特点与作用本研究通过分析NAs治疗与未治疗人群的RT突变,首次验证了携带rtL229V突变的HBV在体外的复制能力明显减弱并表现出对LMV的耐药性;当HBV发生rtM204V与rtL229V二联突变时,其对ETV的敏感性大明显下降。上述结果为临床用药的选择及疗效的评估提供了实验依据。3.HBV X区准种在HBV相关原发性肝细胞癌中的特点与作用本研究使用克隆测序的方法,发现与癌旁组织内的HBV X区准种相比,肝癌组织内HBV X区准种的异质性、演化模式及突变特点都存在明显差异。该发现首次揭示了HCC患者中HBV X区准种在肝癌组织与癌旁组织中的演变差异,为揭示HBV的致癌机制提供了新的思路。4.HBx-T81P/S101P/L123S在原发性肝细胞癌发生中的作用机制本研究通过对HBx-T81P/S101P/L123S稳转细胞株的功能学验证,发现HBx-T81P/S101P/L123S可促进肝癌细胞系的增殖与基因组的不稳定。通过对相关分子表达水平的检测及MYC敲减后细胞功能学的验证,发现敲减MYC后,Huh7-Lv TM细胞的增殖水平的下降幅度明显高于其他稳转细胞系。因此,笔者认为HBx-T81P/S101P/L123S主要通过MYC调控宿主细胞的恶性增殖与基因组的不稳定,进而导致原发性肝细胞癌的发生发展。