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前言 新生儿急性肾损伤是新生儿危重和致死的主要原因，常由新生儿窒息、冷伤、休克、溶血、失血等多种原因引起，其重症导致新生儿急性肾功能衰竭（ARF），并进一步继发多脏器功能衰竭而致新生儿死亡。其中围生期窒息是发病的主要危险因素。 围生期窒息的主要病理生理特点是：缺氧导致的组织细胞一系列代谢紊乱和器官损伤，肾脏因其组织高代谢率而成为主要损伤对象。围生期窒息主要发生在宫内，其中产前、产时因素占80％-90％，由于成功地建立宫内缺血再灌注损伤模型，在此研究领域取得了一定的进展。 血管紧张素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ，AngⅡ）是肾脏最主要的有生物活性的物质，通过受体发挥作用，根据其药理特性的不同主要分为两个亚型：1型（AT1受体亚型），2型（AT2受体亚型），已知传统的AngⅡ的主要作用都是通过AT1受体进行的，而对AT2受体的功能尚不完全清楚。已明确AT2受体在胚胎期高表达，生后迅速下降，可见其在胚胎发育中的作用。有研究表明：在一些病理情况下，已经不表达或表达很少的AT2受体又可以重新表达或表达增强，提示该受体可能参与了一些疾病的病理过程。 缺血再灌注肾损伤的病理过程为：在缺血早期肾素-血管紧张素系统发挥作用，产生缩血管作用，随后内皮损伤、进而细胞粘附产生炎症反应，导致细胞的损伤甚至死亡（坏死或凋亡）。作为AngⅡ的一个在胚胎期高表达的受体，AT2在宫内缺血再灌注性损伤后胎鼠肾脏中的表达是否出现变化?尚未见研究。研究表明：凋亡是缺血再灌注损伤的关键环节，以往对凋亡的研究多在慢性缺氧或其它慢性损伤，胎鼠急性缺血再灌注损伤后是否也出现凋亡?未见此方面的研究。 体内实验，我们通过胎鼠宫内急性缺血再灌注损伤模型，用免疫组化技术结合RT-PCR分析了AT2受体的表达，用TdT介导的生物素化-dUTP原位缺口末端标记（TUNEL）技术分析了肾脏细胞的凋亡，并用免疫组化染色半定量分析半胱氨酸蛋白酶32（Caspase-3）的表达。探讨了缺血再灌注肾损伤后AT2受体的表达及凋亡细胞的变化，但二者之间的联系如何?肾脏细胞尤其是对损伤最敏感的肾小管上皮细胞的凋亡是否由A飞受体介导?体外实验，我们取新生大鼠的肾小管上皮细胞原代培养，传代后分别用Angn及CGP一421 12A（选择性的ATZ受体激动剂）诱导，探讨不同药物在不同浓度及不同作用时间对肾小管上皮细胞凋亡的影响，流式细胞仪分析凋亡细胞指数，RT一PCR半定量分析A几受体的表达，进一步探讨A毛受体在Angn诱导的肾小管上皮细胞凋亡中的作用。材料和方法 一、体内实验部分 1.动物模型的制作 孕21天Wistal大鼠腹腔麻醉后，下腹正中开口，无创动脉夹钳夹一侧供应子宫的动静脉血管，对侧未钳夹宫角的胎鼠为对照组（假手术组），钳夹时间分别为5而n，巧而n，30而n，达到要求后，取下动脉夹行再灌注，再灌注时间分别为O而n，3Omin，Zh，6h，24h。 2.标本采集及处理 满足要求后立即剖宫取鼠，断头处死，取出双侧肾脏，一196℃液氮中贮存待检。各组分别取同一位置的冰冻肾组织，以CM（chicken musde，鸡肌肉组织）为载体，制成组织微阵列，冰冻切片厚度为6林m，连续切片，分别用冷丙酮及多聚甲醛固定，一20℃保存待检。切片剩余肾组织分别标记于一80℃贮存待PCR分析。 3.实验方法 （l）HE染色:取一196℃冰冻肾组织，切片，苏木精染色，伊红复染，中性树脂封片，光镜下观察形态学改变。 （2）免疫组化分析:分别选用特异的A毛受体抗体、Caspase一3抗体，用链菌素亲生物素一过氧化酶法（S一P法）检测肾脏ATZ受体及CasPase一3的表达和定位。 （3）末端脱氧核昔转移酶介导的缺口标记法（TUNEL）:取肾组织切片，固定后行TUNEL分析，测定肾脏细胞的凋亡。 （4）RT一PCR半定量分析:Trizol法提取总RNA，逆转录后，PCR扩增，日一actin为内参照，半定量分析AT ZmRNA的表达。 4.统计学分析 数据用又士s表示，用SPSS for Windows ro .5软件对数据进行析因分析，组间两两比较采用巧D法，单因素分析采用ANOVA法，P<0.05为显著差异界限。 二.体外实验部分 1.肾小管上皮细胞原代培养及传代 用机械研磨加酶消化法取新生Wistar鼠肾小管上皮细胞（Ren吐Tubu-lar CellS，RTCs），进行原代培养，待细胞融合后传代，实验用传代细胞。 细胞传代后，平均细胞于各皿中，分别加人不同浓度的Angn和 CGP-42 1 12A（特异的ATZ受体激动剂）诱导细胞，在不同时间进行观察。 2.实验方法 （l）HE染色培养皿内铺片，待细胞爬满玻片后，取玻片HE染色，观察细胞形态学。 （2）电镜收集细胞，固定后行电镜切片，电镜下观察细胞的超微结构。 （3）细胞免疫化学方法（CCH）用特异的Cytokerin一18抗体，利用CCH技术，鉴定培养的肾小管上皮细胞;用ATZ受体抗体，分析细胞在用药物诱导后ATZ受体的表达。 （4）TUNEL分析测定药物诱导前后细胞的凋亡。 （5）流式细胞仪分析收集细胞，PI染色，上流式细胞仪进行细胞凋亡测定。 （6）RT一PC