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研究背景:依普黄酮(ipriflavone,IP)是一种异黄酮类植物性雌激素的衍生物,在化学结构上类似于雌二醇,对于作用于骨组织、抑制骨吸收具有显著疗效,可产生类似雌激素样的抗骨质疏松的作用,目前广泛应用于临床、用于改善原发性骨质疏松症(Osteoporosis,OP)、治疗绝经后妇女的OP以及其他一些骨代谢性疾病,因其代谢过程类似体内生理过程,且不产生应用雌激素所致的副反应,故具备良好的应用前景。G 蛋白偶联雌激素受体 1(G coupled-protein estrogen receptor 1,GPER1)是一类近来逐渐成为研究热点的、定位在细胞膜和细胞器膜的功能性膜雌激素受体,相关研究表明,雌激素可与之结合,进而激活下游的多种细胞内反应,包括激酶激活、离子通道以及多种信号通路的激活。G15是GPER1的细胞渗透性非甾体拮抗剂,可特异性地抑制GPER1的活化。在MAPKs家族中,p38MAPK信号通路是较为重要的组成部分。孙宪昌等通过构建帕金森病大鼠模型,证明人参皂苷Rg1对NF-κB及MAPKs(ERK1/2、JNK、p38)信号通路活化的抑制是通过GPER1实现的。SB203580是一种ATP竞争性的p38 MAPK信号通路选择性的抑制剂,被广泛应用于实验研究,在探究p38 MAPK信号通路是否参与生物调节过程的实验中,可以提供较为有力的证据。实验目的:该实验的目的在于对体外培养条件下和依普黄酮的刺激下,小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1的增殖和成骨分化的变化情况进行初步探究,并从中筛选其最佳浓度,随后探索p38MAPK信号通路和GPER1在依普黄酮促进MC3T3-E1细胞成骨分化过程中的作用,为依普黄酮在临床上应用于骨缺损治疗可行性提供理论实验基础。实验方法1、小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1的体外培养:包括细胞培养、传代、复苏和细胞冻存等。2、细胞活性检测试剂盒(Cell-counting kit-8,CCK-8)检测法和碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性检测法分别检测在依普黄酮刺激下、MC3T3-E1细胞增殖及成骨分化程度的变化情况,并根据所得数据从中筛选促进其增殖及成骨分化的药物最佳浓度。3、茜素红染色及NBT/BCIP碱性磷酸酯酶显色试剂盒进一步验证所得依普黄酮药物浓度对MC3T3-E1增殖及成骨分化的促进作用。4、利用 Western Blot 和 RT-PCR技术检测 GPER1 和 ALP、Runx2(Runt related transcription factor 2)的蛋白表达水平和mRNA的表达水平,通过Western Blot检测p38蛋白和磷酸化p38蛋白的表达水平变化,探究并验证p38MAPK信号通路在此过程中的变化以及可能发挥的作用。5、应用SB 203580—p38MAPK信号通路ATP竞争性抑制剂、G15—GPER1特异性抑制剂以进一步验证基于GPER1的p38MAPK信号通路途径在该过程中可能发挥的作用。6、统计学分析:本实验所得数据采用Graphpad Prism 6软件进行统计学分析,应用t检验对两组实验数据之间进行比较,应用配对t检验的方法对两组实验数据不同时间点之间的差异进行比较,应用单因素方差分析的方法对多组数据之间进行比较,实验组与对照组在P<0.05时被认为具有统计学意义。实验结果:在MC3T3-E1细胞被体外培养的条件下,1×10-7mol/L依普黄酮对其增殖、ALP活性增加及矿物质沉积增多均有较为明显的促进作用(P<0.05)。相较于对照组而言,实验组的GPER1、ALP、Runx2及p-p38的基因表达水平均呈上调趋势(P<0.05)。应用GPER1的抑制剂G15后,p38MAPK信号通路的激活在一定程度上受到了阻断;应用SB203580可在一定程度上阻断IP对ALP、Runx2表达的促进作用。结论:1、实验设计浓度的依普黄酮均可在一定程度上促进MC3T3-E1细胞的增殖及成骨分化,并且其体外促进作用最佳浓度为1×10-7mol/L;2、在依普黄酮促进MC3T3-E1细胞的增殖及成骨分化的过程中,基于GPER1的p38MAPK信号通路途径可能发挥重要的作用。