染料木素,是一种大豆异黄酮类化合物,同时还是酪氨酸激酶抑制剂,具有雌激素样作用,广泛存在于金雀花、皂荚、槐角等豆科药用植物中,在大豆胚轴中含量也较为丰富。虽然国内外已大量报道染料木素具有抗肿瘤和治疗骨质疏松等药理作用,但染料木素作为单体异黄酮类植物提取物,对糖尿病的预防控制药理学作用和机理还缺乏系统研究。糖尿病在中医中被称为消渴证,是一种常见的代谢紊乱性疾病。目前临床上将其分为I型(胰岛素依赖型)和II型(非胰岛素依赖型)两种。近年来随着人们生活水平的提高,这种病的发病率越来越高,却没有能够彻底根治的药物。目前多采用西药治疗糖尿病,虽疗效快、作用直接,但结果欠稳定,且口服时常需有一定的适应症和存在不良反应等缺陷。人类干细胞中的Wnt信号路径在2型糖尿病患者胰腺的产胰岛素细胞中被上调,另外,CD30及相关基因在人类胚胎干细胞(hESCs)中表达量的高低反映着自我更新能力的强弱及基因核型是否稳定。CD30及相关基因在hESCs中表达量的增高预示着核型不稳及癌化倾向。本文通过三个实验部分分别研究染料木素对Ⅰ型和Ⅱ糖尿病大鼠的作用,及体外培养的hESCs中CD30及Wnt等路径中的相关基因表达的影响。一、染料木素对Ⅰ型糖尿病作用部分：本实验体内部分,采用四氧嘧啶一次性腹腔注射诱导产生Ⅰ型糖尿病大鼠模型。将I型糖尿病模型大鼠分为糖尿病模型组、染料木素高剂量组(30mg/kg/day)、染料木素中剂量组(18mg/kg/day)染料木素低剂量组(9mg/kg/day)及溶媒吐温-80组,再将与其他试验组相同数量的同龄正常大鼠作为正常对照组进行实验。正常对照组和I型糖尿病模型组给予等体积生理盐水,溶媒吐温-80对照组每天给与等体积的含有少量Tween-80的蒸馏水。每天记录大鼠的进食、饮水、尿量与体重数据,同时观察皮毛颜色及活动等生长情况,定期鼠尾采血检测血糖变化。连续灌胃(ig)染料木素给药4周后,所有动物禁食不禁水12小时,剪尾采血测定糖耐量。继续给药1周后,再禁食不禁水12小时,进行戊巴比妥纳麻醉并心脏采血,取血清,按相关试剂盒方法测定血糖及血清胰岛素,最后处死动物取肝脏及后腿肌肉测定肝糖原和肌糖原。本实验体外部分,分离大鼠胰岛细胞,并机进行体外原代培养,研究不同浓度的染料木素对四氧嘧啶致损伤的原代大鼠胰岛细胞的保护作用。MTT测定四氧嘧啶损伤及经过不同浓度染料木素处理过的胰岛细胞的生存和增殖能力。通过体内体外实验,我们首次证明,染料木素可降低由于四氧嘧啶损伤胰腺而导致的胰岛细胞数量减少和产生的高血糖。染料木素对糖尿病鼠的有效治疗(改善胰岛细胞的活力和增殖能力)可能是基于高剂量染料木素对糖尿病具有明显的治疗效果的原因。染料木素可剂量依耐性地降低高血糖和胰岛损伤,并且其有效剂量明显高于日常的食物摄取量。因此,有效增加和补充染料木素的摄取量,被认为是通过饮食调整和改善糖尿病症状的途径之一。另外,实验结果首次显示,高剂量染料木素能够降低四氧嘧啶损伤导致的胰岛细胞数量的减少,并且体内和体外都可促进胰岛细胞数量和功能的恢复。这些结果预示染料木素具有有效防治糖尿病的作用。二、染料木素对II型糖尿病作用部分：采用小剂量一次性腹腔注射链脲佐菌素和同时饲喂高脂饲料建立II型糖尿病大鼠模型(非胰岛素依赖型),再用不同剂量的染料木素灌胃给药处理6周。通过测定血糖、糖耐量、血清胰岛素,C-肽、TC, TG, LDL-C,肝糖原和肌糖原水平,分析染料木素对II型糖尿病大鼠的作用。本试验结果显示,染料木素能明显降低II型糖尿模型大鼠血清胰岛素水平,使C-肽值趋于正常。同时,染料木素可降低TC, TG, LDL-C,肝糖原和肌糖原含量,升高HDL-C及HDL-C/LDL-C比值,说明Gen可有效纠正型糖尿病大鼠的胰岛素抵抗和脂质代谢紊乱,改善肝脏和肌肉组织在糖代谢过程中的中转作用和糖耐量异常状况,降低Ⅱ型糖尿病并发粥样硬化性冠脉疾病的危险。Gen的作用机制可能是,通过增加胆固醇的逆向转运,促进HDL-C对血浆及外周组织胆固醇的清除来降低肥胖和胰岛素抵抗,使机体糖代谢向良性循环发展。三、染料木素对hESCs形态学及CD30和相关基因表达的影响：对体外培养的人类胚胎干细胞系CA1、H1及H9,我们分别用不同浓度的染料木素或PP2连续处理,通过显微照相观察hESCs的形态学变化,并结合QPCR和west blotting结果分析染料木素对CD30及Wnt等路径中的相关基因表达的影响。通过对结果的对比分析,以求得出可能的染料木素对hESCs形态学及CD30和Wnt等路径中的相关基因表达的影响可能的分子机制及信号路径。本试验结果显示,体外染料木素对hESCs的处理,12.5uM是最佳的浓度。低于此浓度,对于维持hESCs的形态学特征及自我更新能力和预防分化的效果不显著；高于此浓度,则表现出一定的毒性作用。另外,12.5uM的染料木素连续处理hESCs CA1 13天可以使CD30的表达降低60%,达到最低,同时可以使E-cadh降低60%, Nanog降低50%,同时其他相关基因的表达无明显变化。而12.5uM的染料木素连续处理hESCsH9 14天可以使CD30的表达降低80%,达到最低,同时可以使E-cadh降低60%,Nanog降低50%,NF-kB降低接近60%,同时其他相关基因的表达无明显变化。因此,浓度为12.5uM的染料木素可以有效预防基因不稳与核型改变,但对于不同的hESCs细胞系,达到最佳处理效果的时间长短不一。从实验结果可知,12.5uM的染料木素对于hESCs H9的处理时间要长于CA1,才能达到对于CD30及Wnt等路径中的相关基因抑制的理想效果。