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哈氏弧菌是水产养殖经济动物的条件致病菌,大量使用抗生素控制弧菌病导致弧菌的耐药性和耐药菌数目日益增多,使弧菌病的控制变得更加困难,给水产养殖业带来巨大的经济损失。关于致病菌耐药机制的研究发现,抗生素作用于致病菌时会引起细胞内的氧化应激,从而损伤或杀死细胞,因此抗氧化系统通过对ROS的清除成为一种致病菌耐药形成的非经典机制。本研究以哈氏弧菌ZJ0603基因组DNA为模板,通过同源引物克隆、分析了哈氏弧菌gs、gcs和gr基因。结果表明,gs基因有951 bp的ORF,编码316个aa,预测其相对分子量为35.19 kDa;gcs基因有1335 bp的ORF,编码444个aa,预测其相对分子量为50.37 kDa;gr基因有1356 bp的ORF,编码451个aa,预测其相对分子量为48.90 kDa;Blast分析发现哈氏弧菌gs、gcs和gr基因与副溶血弧菌同源性分别为99%、91%和98%,与溶藻弧菌分别为98%、90%和98%。分别构建了三个基因的原核表达载体pET-gs,pET-gcs和pET-gr,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功诱导表达。在最佳表达条件下测定三株重组菌对强力霉素和诺氟沙星的药物敏感性变化,结果表明重组菌对强力霉素的耐药性增强。利用药敏试验和试管二倍稀释法筛选出分别对两种抗生素具有抗性的耐药菌,运用RT-PCR技术,分析了敏感菌和耐药菌中GSH抗氧化系统相关基因的相对表达量。结果显示,各基因在耐药菌中的表达量显著高于敏感菌。采用分光光度法分别测定敏感菌和耐药菌GSH抗氧化系统相关酶的活性和GSH含量,结果表明同一菌株在筛选前和筛选后的酶活性和GSH含量具有显著差异,即耐药菌的酶活性和GSH含量显著高于敏感菌。敏感菌和耐药菌在抗生素的刺激下OH·含量和酶活性均发生显著变化,且敏感菌的OH·含量和酶活性增加倍数高于耐药菌,表明抗生素刺激引起细胞内的氧化应激,耐药菌不容易受到氧化损害。通过胞外添加GSH或GCS抑制剂BSO后比较不同细菌药物敏感性的变化,以进一步验证它们的功能。结果显示,添加GSH后敏感菌和耐药菌对诺氟沙星的耐药性增强,GSH相关酶酶活性升高;添加BSO后敏感菌和耐药菌的GCS酶活性降低,对诺氟沙星的耐药性降低。总之,诺氟沙星和强力霉素能够引起哈氏弧菌的氧化应激,哈氏弧菌GSH抗氧化系统与其对这两种药物耐药性的形成存在一定相关性。