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半乳糖凝集素(Galectins)是凝集素家族中一类较为经典的半乳糖结合蛋白,结构中包含对β-半乳糖苷具有特殊亲和力的1至2个糖基识别结构域,该结构域约由140个氨基酸构成,识别程度较高且氨基酸序列高度保守。Galectins在许多方面都发挥着重要的生理功能,例如生长调节,细胞粘附,细胞凋亡,免疫反应等过程,并且在治疗某些疾病中也起到了关键的作用。其中的Galectin-10(Gal-10)是半乳糖凝集素家族中的一种原型半乳糖凝集素,只含有单个糖基识别结构域,主要以同源二聚体形式存在,大多分布于嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞中。在体内可以特征性地形成双锥体六角形晶体,又被称为Charcot-Leyden晶体蛋白(CLC)。嗜酸性粒细胞存在于呼吸道,淋巴结,脾脏等多种组织,与各种疾病相关,包括哮喘,过敏性鼻炎,急性髓性白血病(Acute Myelogenous Leukemia,AML)等。自Galectin-10被发现以来,已有160多年的历史,其可在人体内自发形成蛋白质晶体。Galectin-10的三维晶体结构虽已被解析出来,但是目前的结果显示Galectin-10不能结合乳糖,原因尚未完全清楚。本文的研究思路通过突变Galectin-10野生型糖识别结构域的关键位点,重点分析突变体结构与活性之间的关系,从突变体的二聚化水平,晶体的结构解析,蛋白活性以及在细胞中的分布等方面进行研究,可为相关疾病的治疗带来新的思路和方向。本文具体的研究内容、方法以及研究成果介绍如下:首先通过阅读已发表的文献并分析结构,确定Galectin-10野生型的关键氨基酸位点,然后分别进行点突变,合成获得5个重组质粒,在大肠杆菌中独立表达。利用Ni-NTA亲和层析的方法进行提取、纯化,得到纯度较高的蛋白质。将得到的Galectin-10野生型及5个突变蛋白分别进行结晶,通过坐滴法筛选适合晶体生长的条件,然后通过悬滴法对溶液浓度、pH等晶体条件进行优化以得到形态规则的晶体。通过比较Galectin-10突变体的结构与野生型蛋白结构之间的区别,解析突变体与乳糖共结晶的结构,进而分析这些突变体对乳糖的结合能力和对蛋白质二聚化的影响。结果显示突变体E33A能够微弱地结合乳糖,而其他蛋白不能。通过蛋白质分子筛层析实验研究这些Galectin-10突变体的多聚体形式,结果显示突变体W127A为单体结构,说明了127位色氨酸(Trp127)是Galectin-10形成二聚化的关键氨基酸。此外,红细胞凝集实验,糖阻抑实验以及乳糖胶亲和层析实验用于补充研究Galectin-10野生型及突变体的相关活性。在红细胞凝集实验中,突变体W127A表现出比野生型Galectin-10及其他突变体更高的血细胞凝集活性。在红细胞凝集糖阻抑实验中,突变体E33A对乳糖敏感,而其他突变体不敏感。另外,突变体W127A可与乳糖胶结合,这表明W127A单体的开放碳水化合物结合位点可以与乳糖结合。嗜酸性粒细胞的免疫荧光显微镜检查显示,在细胞核中有相当数量的Galectin-10浓缩颗粒。本论文中选择带有绿色荧光标签的pEGFP-N1作为表达载体,利用分子克隆技术成功构建重组质粒。同时利用细胞生物学的技术手段,包括细胞传代培养,细胞转染,细胞核荧光染色等操作将重组质粒转入宫颈癌细胞(HeLa细胞)中,观察其分布和表达。结果显示,EGFP标记的Galectin-10野生型及各突变体均匀地分布在HeLa细胞的细胞核内,表明Galectin-10可能在细胞核中进行动态交换,而突变体W72A分布在细胞质中,无法进入细胞核,猜测Trp72对于Galectin-10转运到细胞核中是至关重要的。