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目的:明确乳腺癌患者组织标本中TAMs表型以及PD-L1和VEGFR-2以及CD3+T细胞分布表达情况。小鼠乳腺癌细胞4T1培养液诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7构建TAMs模型,检测TAMs细胞模型VEGF蛋白、VEGFR-2及PD-L1受体的表达,明确M2型TAMs高表达VEGF蛋白、VEGFR-2及PD-L1受体。体外实验明确阻断VEGF/VEGFR-2信号通路逆转TAMs极化对乳腺癌T细胞免疫的作用。方法:(1)免疫组化检测乳腺癌患者组织标本:乳腺癌组织TAMs表型、PD-L1、VEGF和VEGFR-2蛋白表达以及CD3+T细胞浸润的情况。(2)小鼠乳腺癌细胞4T1培养液诱导小鼠单核-巨噬细胞RAW264.7小鼠巨噬细胞构建TAMs细胞模型:采用流式细胞术检测诱导前后小鼠单核-巨噬细胞RAW264.7M2型标志物CD206的表达变化(免疫标志:F4/80+CD206+),M1型巨噬细胞FcγⅢ/Ⅱ受体表达变化(免疫标志:F4/80+CD16/32+),采用流式细胞术、Western blot法及免疫荧光检测诱导前后小鼠单核-巨噬细胞RAW264.7中VEGFR-2及PD-L1蛋白表达。采用ELISA法检测VEGF、IL-10、IL-12、TGF-β等细胞因子的分泌水平,QPCR法检测VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2以及VEGFR-3m RNA水平的表达。(3)建立TAMs诱导模型,与诱导后未干预组对比,设立四个干预组阻断VEGF/VEGFR-2信号传导:VEGFR-2基因沉默组,VEGF抗体(贝伐单抗)组,VEGFR-2受体阻断(阿帕替尼)组以及联合阻断(贝伐单抗+阿帕替尼)组。VEGFR-2基因沉默组用VEGFR-2sh RNA慢病毒转染沉默VEGFR-2基因的表达,VEGF抗体(贝伐单抗)组用20ug/ml贝伐珠单抗处理,VEGFR-2受体阻断(阿帕替尼)组用8n M阿帕替尼处理,联合阻断(贝伐单抗+阿帕替尼)组则用20ug/ml贝伐珠单抗+8n M阿帕替尼处理。与诱导后未干预组对比,利用流式细胞术检测四个干预组TAMs表型标记物的改变,利用Western Blot法检测干预后VEGFR-2和PD-L1蛋白水平的改变,ELISA法检测VEGF、IL-10、IL-12、TGF-β、TNF-α、Arg-1、i NOS等细胞因子的表达。(4)采用磁珠分选分离CD8+T细胞。设置诱导后未干预组,四个干预组VEGFR-2基因沉默组、VEGF抗体(贝伐株单抗)组、VEGFR-2受体阻断(阿帕替尼)组及联合阻断(贝伐单抗+阿帕替尼)组分别处理24h与分选得到的CD8+T细胞共培养48h,收集共培养后的CD8+T细胞与小鼠乳腺癌细胞4T1共培养。利用CCK8法检测CD8+T细胞增殖功能的改变。采用ELISA法检测CD8+T细胞分泌的IFN-γ、TNF-α细胞因子改变。LDH释放法检测CD8+T细胞对小鼠乳腺癌细胞4T1的破坏和溶解作用。结果:(1)免疫组化法检测乳腺癌患者组织标本发现,与正常乳腺组织相比,大量肿瘤相关巨噬细胞TAMs(分子标记CD68+)浸润乳腺癌组织,主要表现为M2型TAMs(分子标记CD163+)肿瘤相关巨噬细胞浸润,而M1型TAMs(分子标记CD86+)肿瘤相关巨噬细胞浸润减少(见图1);乳腺癌间质CD3+T淋巴细胞浸润增加,而乳腺癌癌巢内浸润的CD3+T淋巴细胞减少,乳腺癌癌巢及间质PD-L1、VEGF及VEGFR-2蛋白可见阳性表达。(2)流式细胞术检测经小鼠乳腺癌细胞4T1上清液诱导小鼠单核-巨噬细胞RAW264.7后细胞表面分子标志的表达:M1型(表面分子标记F4/80+CD16/32+)细胞比例由诱导前12.95%经诱导后降至4.47%,M2型(表面分子标记F4/80+CD206+)细胞由诱导前4.44%经诱导后升至18.51%,流式结果提示诱导后小鼠单核-巨噬细胞RAW264.7细胞向M2型TAMs极化。细胞免疫荧光IF检测显示,与未诱导的小鼠单核-巨噬细胞RAW264.7相比,诱导后的小鼠单核-巨噬细胞RAW264.7表达VEGFR-2量明显增高,并且VEGFR-2表达量明显比VEGFR-1和VEGFR-3表达量高。Western blot法检测发现,与未诱导的小鼠单核-巨噬细胞RAW264.7相比,诱导后小鼠单核-巨噬细胞RAW264.7中VEGFR-2及PD-L1蛋白表达水平明显升高。流式细胞术双染结果证实小鼠单核-巨噬细胞RAW264.7经小鼠乳腺癌细胞4T1培养液诱导后M2型TAMs由50.1%升高到83.1%,而VEGFR-2表达在M2型细胞中的比例由33.7%升至48.5%。提示肿瘤相关巨噬细胞向M2型TAMs极化同时伴随VEGFR-2表达增高,证明M2型TAMs高表达VEGFR-2蛋白。小鼠单核-巨噬细胞RAW264.7经小鼠乳腺癌细胞4T1培养液诱导后,PD-L1表达在M2型细胞中的比例由0.56%升至15.62%,提示肿瘤相关巨噬细胞向M2型TAMs极化同时伴随VEGFR-2表达增高,WB检测发现诱导后肿瘤相关巨噬细胞向M2型极化,而PD-L1表达水平升高,阻断信号传导后,肿瘤相关巨噬细胞极化逆转,向M1型极化,PD-L1表达水平下降,流式细胞术和WB结果表明PD-L1水平由M2型肿瘤相关巨噬细胞升高而升高,M2型高表达PD-L1。ELISA检测结果显示诱导后Th1型炎症因子IL-12分泌减少,Th2型炎症因子(VEGF、IL-10、TGF-β及ARG-1)分泌增多。QPCR法结果检测发现诱导后VEGF、VEGFR1、VEGFR-2以及VEGFR-3 m RNA表达水平升高。(3)与诱导后未干预组对比,流式细胞术显示四个干预组VEGFR-2基因沉默组、VEGF抗体(贝伐株单抗)组、VEGFR-2受体阻断(阿帕替尼)组及联合阻断(贝伐株单抗+阿帕替尼)组M2型TAMs比例下降,M1型TAMs比例升高,阻断VEGF/VEGFR-2信号传导后,肿瘤相关巨噬细胞向M1型极化。Western Blot法检测发现VEGFR-2基因沉默组、VEGF抗体(贝伐株单抗)组、VEGFR-2受体阻断(阿帕替尼)组及药物联合阻断(贝伐株单抗+阿帕替尼)组干预处理后,VEGF/VEGFR-2信号传导阻断,VEGFR-2和PD-L1蛋白表达水平明显下降。ELISA法检测结果显示IL-12、i NOS等Th1型炎症因子升高,而VEGF、IL-10、TGF-β等Th2型细胞因子的表达下降。(4)与空白对照组相比,四个干预组VEGFR-2基因沉默组、VEGF抗体(贝伐株单抗)组、VEGFR-2受体阻断(阿帕替尼)组及联合阻断(贝伐株单抗+阿帕替尼)组干预处理后与CD8+T细胞共培养,CCK8法检测显示共培养48h后CD8+T细胞活性增强。ELISA法检测CD8+T细胞分泌的IL-2、IFN-γ、TNF-β细胞因子水平升高。LDH释放法检测提示共培养后CD8+T细胞对小鼠乳腺癌细胞4T1的溶解作用增强。阻断VEGF/VEGFR-2信号传导后,肿瘤相关巨噬细胞表型逆转,向M1型极化,促进T细胞的免疫活性。结论:(1)乳腺癌组织中的PD-L1、VEGF和VEGFR-2蛋白可见阳性表达(2)乳腺癌间质淋巴细胞浸润增加,癌巢内浸润的CD3+T细胞减少(3)肿瘤相关巨噬细胞主要表现为M2表型(4)M2型TAMs高表达PD-L1、VEGFR-2蛋白(5)阻断VEGF/VEGFR-2信号传导促进TAMs向M1型极化(6)阻断VEGF/VEGFR-2信号传导逆转肿瘤相关巨噬细胞表型极化,促进肿瘤相关巨噬细胞向M1型极化,增强乳腺癌T细胞免疫作用。