先天性黑蒙症(Leber’s Congenital amaurosis,LCA)是发生最早、最严重的遗传性视网膜病变,全球新生儿患病率是1/35,000。烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶(NMNAT1)广泛表达于各个组织,催化NAD+的生物合成。NMNAT1基因突变可以导致第9型先天性黑蒙症,患者在出生后2个月即表现出视网膜萎缩、眼球震颤等症状。携带NMNAT1无义突变的患者,在刚出生时即可检测到黄斑缺损。NMNAT1突变基因导致LCA的机制尚不清晰,但绝大多数研究将致病原因归根于NMNAT1突变引起的蛋白酶活力的降低。目前为止,LCA9尚无有效的治疗方法。为研究NMNAT1突变的致病机制,实验室根据患者的突变位点,利用PCR定点突变技术构建了NMNAT1突变基因,将野生型及突变后NMNAT1插入不同质粒中,构建突变型及野生型 pEGFP-NMNAT1,pCMV-NMNAT1 及 pET30a-NMNAT1 重组质粒。通过细胞免疫荧光实验确定两个无义突变(Trp85*和Trp169*)改变NMNAT1蛋白的细胞定位,从而影响蛋白功能的发挥。体内酶活实验及体外酶活实验分别用于检测突变对NMNAT1酶活力的影响。酶活力检测实验结果显示Va198Gly突变催化合成的NAD+量明显下降,提示Va198Gly突变显著降低蛋白酶活力。由于NMNAT1是稳定的6聚体结构,半衰期较长,很难通过细胞实验观测到突变对蛋白稳定性的影响。所以通过使用生物信息学分析,预测各个突变点对NMNAT1基因内作用力的影响,判断突变氨基酸对蛋白稳定性的影响。突变后蛋白内部虽然并未形成Clash/Contact键,但氢键及疏水键的分布均发生显著变化。收集体外表达的蛋白,经圆二色谱检测后发现,Met35Thr,Va198Gly,Val151Phe突变后蛋白螺旋结构减少,Leu 153Val,Glu257Lys,Asn273Asp突变后蛋白螺旋结构增多。提高蛋白外部环境温度,实时观察二级结构的变化,发现突变后蛋白解旋温度变小(Tm),螺旋结构稳定性降低。为研究LCA9型疾病的治疗方法,使用CRISPR/Cas9基因编辑技术,根据患者突变类型构建NMNAT1-LCA9小鼠模型,通过视网膜电图(electroretinogram,ERG),眼底成像及光学相干断层扫描(optical coherence tomography,OCT)检测检测小鼠的表型。眼底成像结果显示,小鼠出生3个月后眼底出现针尖样白点,但视网膜各层并未出现异常,视网膜层状结构完整。观察至32周可见眼底病症加剧,针尖样白斑分布密集,但视网膜结构仍保持完整,并无缺损。与Va1152Leu/Glu258Lys 和 Glu258Lys/Glu258Lys 突 变相比Met172Aspfs*22/Glu258Lys小鼠眼底表型出现较早,后期表型恶化严重,眼底针尖样白斑分布更为密集。组织切片结果显示,早期NMNAT1-LCA9小鼠视网膜并未发生明显变化,8个月之后,视网膜外核层、外网状层及内核层均变薄。此外,NMNAT1-LCA9小鼠的光感受器功能也在8个月后显著降低。视网膜的层状结构具有基因治疗的先天的优势,眼病的基因治疗更是走在疾病基因治疗的前列,目前LCA2型的基因治疗已完成了临床3期实验。通过对NMNAT1-LCA9小鼠模型视网膜下腔注射AAV2-CMV-NMNAT1,探索LCA9型疾病基因治疗的可行性。在注射小鼠4个月后对其进行ERG检测,检测结果显示小鼠的光感受器功能得到改善,但随着小鼠周龄增加,光感受器功能逐渐降低。所以AAV2-CMV-NMNAT1基因治疗所使用的病毒计量仍需摸索,以达到降低细胞毒性、提高治疗效果的目的。