研究背景副粘病毒(paramyxo virus)属于单股负链RNA (-ssRNA)病毒。副粘病毒科(Paramyxoviridae)可分为两个亚科：副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)和肺病毒亚科(Pneumovirinae)。副粘病毒亚科包括副粘病毒属(Paramyxovirus)、麻疹病毒属(Morbillivirus)和腮腺炎病毒属(Rubulavirus),副粘病毒属的主要成员有副流感病毒(parainfluenza virus, PIV)、新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)和仙台病毒(Sendai Virus, SeV),其中PIV和NDV是副粘病毒的典型代表；麻疹病毒属只包括一种病毒即麻疹病毒(measles virus, MV),并且只能感染人类；腮腺炎病毒属的代表性成员是流行性腮腺炎病毒(mumps virus, MuV);肺病毒亚科包括肺病毒属,主要有呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)和禽肺病毒(avian pneumo virus, APV)。近年来又新发现了一些副粘病毒的成员,如亨德拉病毒(Hendra virus, HeV)、尼帕病毒(Nipah virus, NiV)、人类偏肺病毒(human metapneumovirus, hMPV)。副粘病毒可以感染人类、哺乳动物和多种禽类,主要引起呼吸系统的感染性疾病,除此之外,还能引起生殖系统、消化系统和神经系统的相关疾病。副粘病毒的形态类似于与流感病毒,但其病毒颗粒的体积稍大于流感病毒,病毒颗粒一般为球形,也可以呈现多形性,直径约150～300nm。副粘病毒的基因组大小在13～16kb之间,为不分节段的单股负链RNA病毒。典型的副粘病毒基因组包含6个基因,分别对应6个开放读码框(open reading frame, ORF),从病毒的3’端开始分别编码衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神经氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase, HN)和大分子蛋白(L)蛋白(3’-NP-P-M-HN-F-L-5’),每个ORF之间存在非编码序列和调控序列。其中,NP、P和L蛋白构成RNA依赖的RNA聚合酶复合体(RNA dependent RNA polymerase, RDRP),在病毒感染宿主细胞后合成病毒的mRNA; M蛋白能够与NP、HN和F蛋白相结合,在病毒粒子的装配及出芽过程中起到重要作用；HN和F蛋白是两种位于病毒包膜表面的糖蛋白,其中吸附蛋白(HN)在副粘病毒的不同成员中具有不同的生物学功能,根据其功能不同,命名有所不同,如在NDV和hPIV中,吸附蛋白同时具有血吸附(HAD)和NA活性,被称为HN蛋白；在MV中,吸附蛋白只有HAD而不表现出NA活性,因此将其命名为H蛋白；在NiV和HeV中,吸附蛋白既无HAD能力,又无NA活性,此时称之为G蛋白。F蛋白能够介导病毒包膜-细胞膜和细胞膜-细胞膜之间的融合,是病毒感染和致病的重要蛋白。在副粘病毒中,绝大多数成员的F蛋白(SV、NiV和HeV例外),需要同源的吸附蛋白的激活才能启动膜的融合过程。目前研究认为,首先HN蛋白与细胞膜表面的唾液酸(sialic acid)受体结合,HN蛋白将某种信号传递至其颈部区域,随后HN蛋白的颈部和F蛋白发生相互作用,将某种激活信号传递至F蛋白,F蛋白发生二硫键的重排使其构象发生改变,原本包埋在F蛋白内部的融合肽暴露并插入到细胞膜中,F蛋白发生内部的β片层和α螺旋之间的转换,重新折叠形成一种6聚体的束状结构(6HB),使病毒包膜和细胞膜足够接近,形成融合小孔,最终完成融合的过程。在这个过程中HN蛋白与受体结合是激活整个事件的关键步骤,本研究拟在以前研究的基础上,针对NDV HN蛋白头部的保守氨基酸(aa),构建突变体,并构建头部缺失的NDV HN突变体,通过检测其功能的改变,弄清HN蛋白头部保守aa对HN多种生活学功能的影响和HN蛋白在促细胞融合过程中所起到的作用和机制。研究目的通过观察HN蛋白头部区域高度保守的aa突变后蛋白功能的变化,定位HN头部的关键aa；根据突变体受体结合能力、NA和促细胞融合活性改变程度的变化,分析这些关键的aa位点对其生物学功能的影响,阐述HN蛋白三种功能间的关系和HN蛋白头部和颈部在激活F蛋白过程中的作用；通过研究NDV HN头部缺失突变体的促细胞融合功能来研究NDV HN颈部在促细胞融合过程中的作用。研究方法1. NDV HN头部保守aa突变体构建：比对NDV、hPIV 3、MV、SeV、HeV和NiV吸附蛋白序列,确定NDV HN蛋白头部3组高度保守的aa,分别为：E401、G402、R403、G468、V469、Y470、Y526、T527和T528,通过定点突变的方法将上述aa突变为丙氨酸(A)；2.突变体的表达：利用阳离子聚合物转染试剂TurboFect Transfection Reagent将含突变HN基因的质粒和野毒株(wt)F质粒共转染BHK-21细胞,利用痘苗病毒-T7瞬时表达系统,表达各个突变体；3.突变体表达效率的检测：NDV HN头部突变体的定性表达情况由简介免疫荧光实验(ⅡFA)检测；利用流式细胞术(FACS)技术分析NDV HN头部突变体在细胞膜表面的表达效率；4.蛋白功能的检测：在细胞表面表达NDV HN突变体后HAD试验定性和定量测定各突变体的受体结合能力；利用R18荧光探针标记的鸽红细胞与共表达突变体HN和野毒株(wt)F蛋白的细胞进行半融合试验,检测NDV HN突变体在促细胞融合的启动过程当中的速率改变和合胞体形成情况；Giemsa染色对各个NDV HN头部突变体引起的细胞融合现象进行定性观察,并且利用指示基因法(report gene method)定量测定各个突变体的促细胞融合功能；NDV HN突变体与β-半乳糖苷酶底物反应后,利用比色法定量测定突变体的NA活性；5.构建HN蛋白头部缺失的NDV HN突变体,分别在37℃和39.5℃的条件下共转染野毒株F蛋白,Giemsa染色观察NDV HN头部缺失突变体介导的合胞体形成情况。研究结果1.突变体E401A、G402A、R403A、G468A、V469A、Y470A、Y526A、T527A和T528A突变体均构建成功。FACS分析表明突变体E401A、G402A、G468A、V469A、Y526A和T527A表达成功,其细胞表面的表达效率分别为wt的69.3%、101.4%、94.6%、92.0%、84.1%和102.9%；而突变体R403A、Y470A和T528A通过ⅡFA和FACS分析均未检测到在细胞膜表面和细胞内部的表达；2. NDV HN蛋白的功能检测结果显示,E401A和Y526A突变体的HAD活性基本消失,降低到wt的7.3%和7.9%,其NA降低到了wt的10.1%和0.4%,促细胞融合活性降低到了wt的2.4%和3.2%；G402A和T527A性突变体的HAD活为wt的71.5%和49.2%,与其神经氨酸酶和促细胞融合活性的下降程度相当,分别为72.8%,35.5%和53.4%和54.2%；G468A的HAD基本没有下降,为wt的93.9%,而其NA下降到了wt的35.3%,促细胞融合活性下降至wt的70.0%,其NA的下降程度远大于HAD活性和促细胞融合活性下降的幅度；与之不同的是V469A突变体的HAD活性为wt的46.5%,NA为wt的68.1%,而促细胞融合活性降低到了wt的12.4%,其促细胞融合活性的下降程度远大于HAD活性和NA下降的幅度；3.HN和F蛋白相互作用实验结果为：第一,免疫共沉淀实验结果表明,融合的程度与HN和F蛋白的相互作用程度成反比,E401A和Y526A突变体仍与F蛋白有较强的相互作用,而HAD活性几乎没有下降的G468A突变体与F蛋白的相互作用则较弱；第二,用R18标记豚鼠红细胞后,与共表达NDV HN和F蛋白的细胞在37℃条件下的融合速率未发生明显变化,但是形成合胞体的数目和直径均小于wtHN和F蛋白共表达实验组；4.头部缺失的NDV HNs与同源的F蛋白共表达时,在37℃和39℃时均出现了合胞体,但是合胞体的数目和直径均小于wt的HN和F蛋白共表达实验组。结论1.E401和Y526位点是NDV HN头部区域有关受体结合的关键aa,其突变导致受体结合活性的丧失；E401A和Y526A突变体所引起的神经氨酸酶和促细胞融合活性的消失是因为受体无法结合所导致的；2.G402和T527位点其突变导致HN受体结合能力、NA和促细胞融合活性的相应降低,但是仍能够引起细胞的融合,说明次位点参与了HN的受体结合过程,但并不是HN蛋白促细胞融合过程中的关键aa；3.G468和V469位点突变所引起的HN受体结合能力、NA和促细胞融合活性的降低程度不同,证明G468和V469在平衡和转换NDV HN蛋白NA和HAD生物学作用的过程中起到了重要的作用；4. NDV HN激活F蛋白的区域在其颈部,融合前未结合受体的HN蛋白头部抑制了F蛋白的融合激活过程。研究背景新城疫病毒(Newcastle disease vims,NDV)属于副粘病毒科,副粘病毒亚科,是副粘病毒的典型代表成员。ND是一种烈性的禽类传染病,其暴发对禽类养殖业产生致命性打击。目前由于减毒活疫苗的使用,ND的流行基本可控制,但是RNA病毒高突变率的特性决定了NDV的潜在威胁无法彻底消除。NDV为不分节段的负链RNA病毒,原先被归类于腮腺炎病毒属,后来基于免疫学、血清学研究和基因特征分析结果,Peeters等学者认为其应列为副祐病毒科中一个单独的属,即现在所说的禽腮腺炎病毒属按照毒力分數NDV可分为强度型(velogenic)、中等毒型(mesogenic)和弱毒型(lentogenic)或无毒型(asymptomatic)。基于F蛋白高可变区(47?420nt)的系统发生分析将NDV分为9型(I?IX),这9个基因型按照出现的时间分为两大分支,第一支是1960s前的I、II、111、IV和IX型,第二支是1960s之后的VI、VII和VIII型,其中IX型出现的时间为1960s之后,但是系统发生分析认为它是来源于III型的一个古老的分支。自然界中,NDV的宿主非常广泛,几乎所有的禽类都是其宿主,而鸡类尤其易感。通常情况下认为,水禽对NDV有较强的抵抗力,感染后并不引起严重的症状或者不发病,因此巧生的水禽类是NDV的储存池。近年来,世界不同地区不断有NDV在水禽中暴发流行的报道,国内也在家养的鷄和鸭中出现了ND的暴发流行。是否是NDV在进化的过程中发生了适应性变异,导致对水禽的致I病性增强的原因仍需要进一步的研究。系统发生分析作为研究病毒进化和演变的强有力工具,在NDV的进化分析和分型中起到了重要的作用。本研究中对NDVBJ株的基因序列特征进行了分析,试图从系统发生的角度探讨NDV的演变过程和起源,W及新的病毒亚型不断出现的可能原因和机制。反向遗传学(reverse genetics)又称为病毒逐救(rescue of virus),是通过人工的方法构建具有感染性的全长cNDA克隆,从而逆向分析病毒致病机制的一种新兴的分子生物学技术。随着RNA病毒反向遗传技术的成熟,已经有多株NDV被挺救成功的报道。这为研究分析NDV的进化及致病机制创造了更好的条件。但是目前成功魅救的NDV病毒主要为弱毒株,而强毒株的搔救少有报道。本硏究构建了强度株NDV BJ株的全长cDNA和辅助质粒系统,旨在捶救NDV BJ株,W进一步的进行副巧病毒致病机制研究和表达外源基因、作为新型疫苗载体等相关的应用性研究。研究目的获得纯化的NDV BJ巧,并测定其毒力;PCR扩增得到NDV BJ株的全序列,测序后利用系统发生的方法分析其进化演变过程和可能的起源;构建全长的cDNA和辅助质粒系统,为下一步的病毒强救王作提供基础。研究方法1.利用有限稀释法通过睡斑试验纯化NDVBJ株,通过9日龄鸡化尿囊腔接种测定鸡胚平均死亡恃间(mean death time,MDT),—日龄錐鸡脑内接种致病指数(intracerebral pathogenicity index,ICPI)测定病毒的毒力。2.设计口对PCR引物,对通过RT-PC民和PCR的方法,分别扩增NDV BJ株基因片段,连接入T载体后,测定NDVBJ株全基因组序列;对其F基因和L基因进行系统发生分析,分析NDV BJ株的进化特征和可能起源。3.根据NDVBJ株的基因序列,寻找基因组中合适的酶切位点,采用基因克隆的方法,构建NDVBJ株的全长cDNA,将其连接入pVAX表达载体。4.分别设计PC民产物和合适的酶切位点,扩増NP(约1.5kb)、P(约1.3化)和L(约6.7化)基因的开放读码框(ORF)后,连接入T载体,测序验证后,根据两端设计的酶切位点,连接入pVAX载体,构建NDVBJ株的辅助质粒pVAX-P,pVAX-NP和pVAX-L。5.巧用PCR扩增病毒的3刑5味端的非编码调控序列,扩增NDV BJ株的leader区和trailer去引物,PCR扩増得到目的片段;设计引物,WpEGFP-N3为模板,扩增EGFP基因;通过重组PC民的方法在Leader区和Trailer区的中间反向插入绿色巧光蛋白(EGFP)基因,构建微基因组pVAX-TGL,验证辅助质粒系统的功能。研究结果1.通过有限稀释法从嗦斑中得到了纯化的NDV BJ株病毒,并通过PCR扩增,得到NDVBJ株全序列为15192nt,序列己上传GenBank(ID:HQ3n394)。2.NDV BJ株的毒力检测结果显示,MDT为。.他,解剖死亡的鸡胚发现有广泛的组织粘连、出血,甚至组织溶解;ICPI为1.92,一日龄维鸡在脑内接种NDVBJ株W后,迅速出现快速剧良、摇头、站立不稳、翅下垂、雍轰等症状,30h内死亡;综上述,NDVBJ株符合强毒株的特征,为强毒株。3.通过对F蛋白高可变区(47?435nt)的系统发生分析结果显示NDV BJ株属于IX型;从亲缘关系上看IX型与m和IV型的关系最近,而与I型和II型的亲缘关系较远,但是总体来看,I型和II型并未与曲、IV和IX型位于同一分支;基于F基因全长的系统发生分析结果表明,I、II、III、IV和IX型位于同一分支,V、VI、VII和vm型位于同一分支从进化关系上分化NDVBJ株属于III型的姐妹分支,是一个古典的NDV毒株的变异株,并且具有近年来NDV流行株的特点。对L基因的系统分析结果显示了同样的结果。4.成功构建了辅助质粒系统;辅助质粒和微基因组能够共转染能够表达EGFP,说明了NP、P和L基因能够正常表达,并形成具有生物学功能的RNA聚合酶复合体。结论1.NDVBJ株是属于新城疫病毒IX型的、毒力极强的分离株,其感染能够引起鸡胚和维鸡的迅速死亡。2.基于系统发生分化NDV BJ株可能是III/IV型和VI-VIII型的重组株,是NDV进化过程中的一个过渡株。3.NDB BJ株的辅助质粒系统能够形成具有生物学活性的RNA聚合酶复合物,能够使微基因组表达绿色巧光蛋白,证明辅助质粒系统构建成功。