红豆草再生体系建立及HCT-C3H基因转化的研究

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红豆草(Onobrychis viciaefolia Scop.)适应性强,营养丰富,因其木质素含量较高,不利于牲畜的消化与吸收。利用基因转化技术将低木质素含量的基因转入红豆草,对降低木质素含量的牧草品质育种有重要意义。本研究建立了红豆草愈伤组织再生体系,利用农杆菌介导法和基因枪法建立了遗传转化体系,将HCT-C3H基因转入红豆草。研究结果如下:  (1)红豆草再生体系的建立  取无菌苗子叶,叶片,下胚轴进行外植体筛选,确定下胚轴为最佳外植体;愈伤诱导培养基为MS+1.5 mg·L-12,4-D+0.4 mg·L-16-BA,暗培养20d,出愈率达95%;愈伤分化培养基为MS+0mg·L-12,4-D+0.5 mg·L-16-BA,光照培养(光周期16h/d),继代培养两次,55d后分化率为26.47%;生根培养基为1/2MS+1 mg·L-1NAA,暗培养3d后再转至光照培养(光周期16h/d),培养20d后,生根率达33.33%。  (2)农杆菌介导法遗传转化体系的建立  以红豆草再生体系为实验基础,选取下胚轴愈伤组织为受体材料,采用农杆菌介导法转化受体细胞,对浸染条件采用正交试验设计。农杆菌浸染条件为Carb(羧苄青霉素)浓度500mg·L-1,菌液浓度OD6000.4,浸染时间15min,共培养时间3d;愈伤组织转至选择培养基,暗培养20d后继代培养一次,再培养20d;愈伤组织转至分化培养基光照培养(光周期16h/d),继代培养两次,待分化出的小苗长至4-5cm时转至生根培养基;小苗暗培养3d后转至光照培养(光周期16h/d)20d,得到3株再生植株。  (3)基因枪法遗传转化体系的建立  以红豆草再生体系为实验基础,选取下胚轴愈伤组织为受体材料,采用基因枪法转化受体细胞。设置轰击距离和轰击次数两项参数,轰击距离9cm,轰击次数1次的参数组合再生芽分化率为3.89%,高于其它组合;愈伤组织转至高渗培养基暗培养16h,转至恢复培养基暗培养7d,转至选择培养基暗培养20d,后继代培养20d;分化培养和生根培养的方法同农杆菌介导法遗传转化体系;得到1株再生植株。  (4)对HCT-C3H基因转化的再生植株进行PCR检测,农杆菌介导法得到的3株再生苗中检测到2株带有目的基冈,转化率为0.313%;基冈枪法得到的1株再生苗中未检测到目的基冈。
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