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背景：已分化的体细胞可以通过体细胞核移植、干细胞提取物共培养、特定因子诱导和细胞融合等方法重编程为多能干细胞，在再生医学领域有巨大的应用前景。其中体细胞核移植技术难度大、成功率低，干细胞提取物共培养和特定因子诱导的方法也都存在耗时长、效率低下等缺点。相比之下，细胞融合诱导体细胞重编程耗时最短，重编程效率也最高，但融合细胞为四倍体，限制了其临床应用，而更适合于用作体细胞重编程机制研究。细胞融合主要有化学方法(如聚乙二醇诱导融合法)、生物方法(如病毒诱导融合法)和物理方法(如电场诱导融合法)三种，这三种方法均已应用于诱导体细胞重编程的研究。其中聚乙二醇在诱导细胞融合过程中，对细胞损伤较大、残留细胞毒性且融合率较低，而病毒诱导细胞融合则存在病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大、实验重复性差等缺点。电融合操作简单、无化学毒性、对细胞损伤小、融合率也更高，已成为研究体细胞重编程的重要手段。在重编程过程中，体细胞多能性基因的表观遗传学修饰是体细胞重编程的关键所在。这些表观遗传学的修饰包括：染色质重塑、组蛋白修饰和DNA的去甲基化，其中DNA去甲基化在体细胞重编程中尤为重要。虽然在哺乳动物体内尚未发现明确的去甲基化酶，但已有研究证实AID(Activation-induced cytidine deaminase)和Tet(ten-eleven translocation)酶可能分别通过对核酸的脱氨酶作用和羟基化实现DNA的去甲基化。目的：采用本实验室自主研发并经过改良的微流控电融合芯片，进行小鼠成纤维细胞和小鼠胚胎干细胞电融合实验，通过流式细胞术筛选出融合细胞，研究融合细胞的细胞生物学特性，证实融合细胞发生了体细胞重编程，并探讨体细胞重编程的去甲基化机制。方法及结果：本研究分为两个部分第一部分：细胞电融合及融合细胞的细胞生物学特性研究1、通过将非融合区用绝缘材料封闭，使电场集中在融合区，改良了微流控电融合芯片，构建了高通量的细胞电融合平台，通过此平台将转染了绿色荧光的mESCs与转染了红色荧光的NIH3T3细胞进行电融合，其平均排队率为44.35%，平均融合率为59.88%，实现了NIH3T3/RFP和mESCs/GFP的高效融合。2、通过流式细胞仪筛选出同时表达绿色荧光和红色荧光的融合细胞，在小鼠胚胎干细胞培养基中进行培养，发现其能够形成类似于mESCs的克隆。qPCR实验发现，NIH3T3细胞不表达多能性基因OCT4和Nanog，mESCs和融合细胞OCT4和Nanog基因mRNA水平较高，且两者统计学无差异。而融合细胞体细胞标记性基因CKAP2和LaminA/C表达下调，与NIH3T3相比分别下降了89%和95%，且融合细胞和mESCs的CKAP2和LaminA/C基因mRNA水平无统计学差异，说明NIH3T3/RFP和mESCs/GFP融合后，融合细胞的多能性基因和体细胞标记性基因表达水平均达到了与mESCs类似的水平，证实了融合细胞发生了体细胞重编程。第二部分：基于微流控芯片的体细胞重编程去甲基化机制的研究1、利用斑点杂交方法检测细胞融合前后甲基化水平的变化，发现NIH3T3的5mC水平较高，几乎不表达5hmC，而mESCs和融合细胞则5hmC水平较高，几乎不表达5mC。通过BSP检测，发现NIH3T3的OCT4和Nanog基因启动子区的甲基化比例分别为64.38%和80%，mESCs的OCT4和Nanog基因启动子区的甲基化比例则为0%和4%，细胞融合后融合细胞OCT4和Nanog基因启动子区甲基化水平也分别降至16.88%和20%。再通过glucMS-qPCR方法检测发现融合细胞在融合后24h、48h、72h和96h的OCT4基因启动子区的甲基化比例分别为85.51%、64.06%、54%和28.04%，各时间点之间甲基化比例有统计学差异，说明融合细胞逐步发生了去甲基化。2、qPCR检测发现，细胞融合后融合细胞的AID,Tet1,Tet2表达上调，分别是NIH3T3的2.9倍，10.5倍和14.4倍，是mESCs的2.1倍，2.2倍和2.3倍，三者之间均有统计学差异。Tet3表达下调，与NIH3T3相比下降了94%，与mESCs水平相似，融合细胞与mESCs两者之间无统计学差异。而NIH3T3,mESCs和融合细胞的TDG和MBD4基因表达水平相似，三者之间无统计学差异。免疫荧光检测也发现了AID在融合细胞和mESCs表达较高，而在NIH3T3中几乎不表达，提示Tet1,Tet2，AID,TDG和MBD4可能参与了融合细胞的去甲基化过程。结论：1、通过改良的微流控电融合芯片，构建了高通量的细胞电融合平台，可实现mESCs与NIH3T3的高效融合，使体细胞重编程为多能性干细胞。2、细胞电融合能够使体细胞多能性基因OCT4和Nanog启动子区去甲基化，从而实现了体细胞重编程过程中关键的表观遗传学修饰。3、细胞融合后AID、Tet1、Tet2基因表达上调，Tet3基因表达明显下降，TDG和MBD4基因表达水平无明显变化，提示AID、Tet1、Tet2、TDG和MBD4可能参与了细胞电融合过程中的DNA去甲基化过程。