胞苷脱氨酶(Cytidine deaminase)属于一种细胞浆内酶,它催化胞苷的水解脱氨反应,在革兰氏阳性细菌和真核生物嘧啶利用途径中,dCTP脱氨酶能催化dCMP转化成dUMP,在革兰氏阴性细菌大肠杆菌中,dCTP在dCTP脱氨酶的作用下生成dUTP,为dTTP合成的关键酶。脱氧胞苷脱氨酶还能够使5-氟胞嘧啶脱氨形成5-氟脲嘧啶(5-FU),5-FU为临床上广泛使用的化疗药物且对由上皮组织来源的恶性肿瘤如肝、胃、肠癌等有较好的临床治疗效果。本文将编码TSP4dCTP脱氨酶的tspdCTP基因亚克隆到表达载体pET-28a和pET-32a中,并将重组质粒pET-28a-tspdCTP和pET-32a-tspdCTP转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行诱导表达。SDS-PAGE分析结果显示,目的蛋白经1mM的IPTG诱导后在大肠杆菌Rosetta(DE3)中高效表达。通过Ni-NTA agarose亲和层析柱纯化表达的tspdCTP,并对其活性,最适作用温度、pH、底物特异性以及金属离子和有机溶剂对其活性的影响进行分析,结果表明重组蛋白活性达到4.12U/mmg,它的最适作用温度和pH分别为60℃和7.5,最佳反应底物是dCTP,2mmol/L的Ca2+和Mg2+对其活性具有明显的促进作用,而同浓度的Ni2+和Cu2+对其活性产生了明显的抑制作用,10%(V/V)的乙酸乙酯和异丙醇对其活性有很明显的促进作用,而同体积比的丙酮对其活性产生明显的抑制作用。此外,本文对tspdCTP脱氨酶的熵值及其热稳定性的关系进行探索,并探索在功能位点及其周围残基结构熵值分布特征对于蛋白的活性以及热稳定性的影响。根据Chan等人提出的蛋白质改造原则,对TSP4的dCTP脱氨酶设计四个突变体,并进行克隆表达及热稳定性分析。结果其中两个dCTP脱氨酶突变体在pET-32a表达系统中表达,在研究其热稳定性时发现,在同一温度下温育同样的时间,系统平均结构熵高的dCTP脱氨酶突变体较未突变的dCTP脱氨酶的热稳定性明显降低,系统平均结构熵低的却明显升高,研究结果符合蛋白质熵值越低,热稳定性越高的理论,但是具体的函数关系还有待进一步的研究验证。同时还证明了在蛋白的保守残基前后4至9个氨基酸处对蛋白进行改造,不会导致蛋白的活性破坏,但是热稳定性发生明显变化。这些结果都为探索高温环境下高温噬菌体生命活动特征提供了更进一步的数据,并为利用熵值研究蛋白质热稳定性机制奠定初步的基础。