MiR-205调控非小细胞肺癌细胞发生上皮—间充质转化过程的机制研究

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背景和目的:世界范围内,肺癌的发病率和死亡率逐年升高,明确肺癌尤其是非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC)的发病机制,对个体化治疗极其重要。上皮-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)使肿瘤细胞获得了侵袭转移能力,构成了肿瘤从原发灶转移的第一步。有研究证实miR-205在乳腺癌中通过调控转录因子ZEB1、ZEB2的表达来调控肿瘤细胞EMT过程的发生。本研究拟探讨:1.miR-205是否参与调控非小细胞肺癌细胞发生EMT过程;2.miR-205通过何种途径调控非小细胞肺癌细胞发生EMT过程。方法:(1)根据文献报道采用5ng/ml TGF-β1刺激非小细胞肺癌细胞A549,H226,观察细胞的形态学改变;然后提取这两株细胞刺激前后的RNA和蛋白,运用Real-timePCR、免疫组织化学、Western Blot方法检测细胞中上皮标记分子E-cadherin以及间充质标记分子N-cadherin、Vimentin在RNA以及蛋白水平的表达;(2)运用Real-timePCR方法检测A549和H226细胞在5ng/ml TGF-β1刺激前后miR-205、ZEB1、ZEB2的表达;(3)在A549、H226细胞中瞬时转染miR-205mimics及阴性对照(negativecontrol,NC),48h后应用Real-time PCR方法检测E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、ZEB1、ZEB2的表达;(4)在A549、H226细胞中瞬时转染miR-205mimics及NC,48h后予以5ng/ml TGF-β1刺激,继续培养48h后运用Western Blot方法检测E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表达。结果:(1)5ng/ml TGF-β1刺激A549,H226细胞后,细胞形态均呈梭形改变,且上皮标记分子E-cadherin表达明显下降,而间充质标记分子N-cadherin,Vimentin表达上升,提示两株细胞均发生了EMT过程;(2)在A549和H226细胞中,miR-205在TGF-β1刺激后有不同程度下降;而转录因子ZEB1、ZEB2在TGF-β1刺激后均有显著上升;(3)瞬时转染miR-205mimics及NC后,在A549细胞中E-cadherin表达上升、ZEB1、ZEB2表达下降,而N-cadherin、Vimentin的表达没有显著变化;在H226细胞中,E-cadherin表达上升,N-cadherin、Vimentin、ZEB1、ZEB2表达均显著下降。(4)瞬时转染miR-205mimics及NC48h后,再次予以5ng/ml TGF-β1刺激48h,发现在A549细胞中,NC组中经TGF-β1刺激后E-cadherin表达显著下调,相对应的mimics组中E-cadherin下调没有NC组中明显。而N-cadherin、Vimentin刺激前后的表达变化在两组中没有显著差异。在H226细胞中,NC组中经TGF-β1刺激后N-cadherin、Vimentin的表达均有不同程度的上升,而mimics组则没有显著变化。结论:我们的结果显示5ng/ml TGF-β1可刺激肺癌细胞A549和H226发生EMT过程。在A549细胞中miR-205可能通过下调转录因子ZEB1和ZEB2的表达来上调E-cadherin的表达,从而抑制细胞EMT过程的发生;而在H226细胞中,异位表达的miR-205可能通过抑制转录因子ZEB1和ZEB2的表达来下调N-cadherin、Vimentin的表达,从而抑制细胞EMT过程的发生。
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