疏花水柏枝内生真菌抗氧化能力分析及应用

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疏花水柏枝(Myricaria laxiflora)是一种分布于三峡河岸带地区的珍稀濒危灌木,由于常年受周期性夏季淹水胁迫,进化出较强的抗涝害胁迫能力,因此具有很强的抗氧化能力。本研究通过总抗氧化能力试剂盒T-AOC(Total antioxidant of capacity)测定169株内生真菌发酵液的总抗氧化能力,分析了不同生境以及不同分离条件下的总抗氧化能力,讨论了不同种属间总抗氧化能力的差异,探讨了高抗氧化活性的内生真菌对大肠杆菌在过氧化氢胁迫下的影响,同时对总抗氧能力和总多酚含量做了初步分析。在应用上对内生菌寄主疏花水柏枝进行了组织培养并成功获得悬浮细胞,分析了培养液的总抗氧化能力值和总多酚含量的关系;筛选出了多株对水稻白叶枯病原菌,魔芋软腐病原菌以及柑橘致腐菌有较好抑菌效果的内生真菌。本研究主要内容包括:  ⑴内生真菌的抗氧化能力与生境以及氧含量关系分析:抗氧化筛选结果表明,内生真菌的总抗氧化能力与其淹水前后的生理环境和有氧以及厌氧的分离条件是密切相关的。淹水后,茎中内生真菌表现的抗氧化能力显著比淹水前高,但在叶中的结果是相反的,说明淹水胁迫对于内生真菌抗氧化能力有显著影响,但不能确定哪种条件分离得到的内生真菌抗氧化性高。有氧条件下,根中的内生真菌抗氧化能力显著的高于厌氧条件下的值,叶中的结果却是相反的,茎中内生真菌抗氧化能力变化很小。上述结果说明淹水胁迫对于内生真菌的抗氧化能力有显著影响。  ⑵内生真菌的抗氧化能力与种属关系分析:169株内生真菌被鉴定为26个属,其中有曲霉,链格孢菌,青霉,栓菌属和根霉比其他属表现较强的抗氧化能力。13株曲霉表现较高的抗氧化活性,说明曲霉可能在寄主疏花水柏枝淹水胁迫中扮演重要的角色。26个属中,有4个属中包含多个种的内生真菌,烟曲霉的抗氧化活性显著高于曲霉的其他属,同样的链格孢(Alternaria alternaria),草酸青霉(Penicillium oxalicum),黄色镰孢菌(Fusarium culmorum)在各属中表现较高的抗氧化活性。有较强抗氧化能力的菌共有24株,包括曲霉(Aspergillus),链格孢菌(Alternaria),青霉(Penicillium),栓菌属(Trametes),根霉(Rhizopus),丝盘霉属(Byssochlamys spectabilis),拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis),拟层孔菌属(Fomitopsis)8个属占总分离菌数的14.20%。通过ClustalX2中进行两两比对,最终得到15株差异较大的内生真菌。  ⑶五株内生真菌发酵粗提物对H2O2致细胞损伤的保护作用:H2O2浓度为800μmol/L可导致50%~60%大肠杆菌细胞死亡,以此H2O2浓度建立氧化应激损伤模型。经过初筛,可知只有内生真菌QY1发酵液提取物是有解除氧化作用的,其提取物浓度在0.4-1.4mg/ml,总多酚含量在11.51-40.28μg/ml时,损伤后的细胞相对存活率在55%-91%。  ⑷疏花水柏枝内生真菌对3株致病致腐菌的抑菌效果:11株内生菌对魔芋软腐病病原菌有抑菌效果,10株内生菌对白叶枯病病原菌有抑菌效果,对两者均有较强抑菌效果的有MG6,MJ7,HG4;QY1(Fungal sp.)、SG4(Penicillium sp.)和SG17(Aspergillus fumigatus)3株具高抗氧化能力的疏花水柏枝内生真菌对柑橘致腐菌具有明显的抑菌效果,内生真菌QY1表现最强的抑菌活性。  ⑸疏花水柏枝愈伤组织与悬浮细胞培养及抗氧化性和多酚含量分析:取疏花水柏枝嫩茎段,以6-BA0.5mg/L+2,4-D0.2mg/L+PVP500mg/L的MS固体培养基,培养30d可以得到大量松散的愈伤组织,加入到同样激素浓度的液体培养基中振荡培养10d后,开始出现悬浮颗粒,继续培养至第25d,溶液变混,但为均一状态,7d后振荡培养得到细胞悬浮体系。用福林酚法测定得到多酚含量为悬浮细胞干重的6wt%;用T-AOC试剂盒测定总抗氧化能力为2.343U/ml。
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