研究背景和目的贫铀（depleted uranium，DU）是天然铀经过提炼浓缩铀(²³⁵U)之后的剩余产物，其²³⁵U含量低于0.712％。由于DU具有良好的穿透性和原料的廉价性，被广泛地用于核电站、平衡锤、辐射防护及军事活动中（如作为装甲材料及弹药成分）。在DU的生产和使用过程中，可能会不规范地释放到环境中，经呼吸道、消化道或皮肤进入体内，对周围居民的健康造成严重地威胁。DU可发射高线性能量转移的α、β粒子，既具有放射毒性，又具有重金属毒性，其生物学影响与接触剂量、持续时间、接触途径等多种因素有关。在大剂量急性暴露的条件下，肾脏是铀急性化学毒性的主要靶器官，可造成严重的肾近曲小管坏死，然而，DU引起肾脏毒性的准确机制还不清楚。在低剂量慢性暴露的情况下，可能会引起一系列有害的效应，如神经行为的异常、生殖毒性、遗传毒性和癌症等，然而，普遍关注的问题——长期摄入DU污染的食物对免疫系统的影响，目前还没有报道。因此，本研究分别建立DU急性暴露模型和经过食入途径的慢性暴露模型，分别评价急性DU暴露对肾脏的影响和慢性DU暴露对免疫系统的影响，深入探索急慢性DU暴露的作用机制，为DU生物学效应的研究打下基础。此外，针对DU中毒的救治，仍是国内外研究的重点和难点。现有的DU促排药在促排效果或安全性方面都或多或少存在问题。金属硫蛋白（metallothinein, MT）是一类广泛存在于哺乳动物器官和组织中的低分子量非酶蛋白，富含半胱氨酸，对重金属离子有很高的亲和力，并能清除多种自由基，可实现对金属的解毒，但其解毒机制仍不完全清楚。MT基因的表达，需要二价锌离子的参与，锌属于高效且安全的MT诱导剂。因此，可试图通过锌诱导机体产生MT来实现DU的解毒治疗，为临床上开发高效低毒的DU解毒药物提供新的思路，具有重要的实用价值和现实意义。研究方法首先分别利用人肾脏近曲小管上皮HK-2细胞和成年Sprague Dawley大鼠，暴露于不同剂量的DU，造成DU急性染毒模型，分别观察暴露于DU后24h对细胞存活率、凋亡及相关酶活力的影响，以及暴露于DU后4d对大鼠肾脏铀含量、肾功能、组织病理学及肾脏组织抗氧化水平的影响。其次，3周龄昆明系小鼠，按照喂食饲料（含DU）剂量的不同分为4组：0（对照组），3（DU3组），30(DU₃₀组)，和300(DU₃₀₀组)mg/kg，喂食长达4个月，造成DU慢性染毒模型，评价小鼠天然免疫和获得性免疫功能的变化。最后，分别利用HK-2细胞、Sprague Dawley大鼠和MT基因敲除小鼠，进行锌对DU中毒的解毒作用及机制的研究，通过组织形态学、细胞超微病理学、流式细胞术、激光共聚焦显微镜技术、酶联免疫吸附试验（ELISA）、分子生物学及蛋白组学等技术方法多角度评价锌对DU的解毒作用，深入探索锌对DU的解毒机制。研究结果及结论1.高于125μM的DU（硝酸铀酰）暴露后24h，均可引起HK-2细胞质膜和溶酶体膜的破坏，而导致乳酸脱氢酶（LDH）和N-乙酰-β-葡萄糖苷酶（NAG）从细胞内释放到培养液中，最终导致细胞的凋亡。另外，将Sprague Dawley大鼠急性暴露于不同剂量的DU（2.5、5、10mg/kg），4d后观察发现，大于2.5mg/kg的DU暴露剂量均可引起明显的肾脏毒性，导致肾脏组织铀含量、血清尿素（BUN）和肌酐（Cr）均明显增高，组织病理学损伤严重，且随着DU暴露剂量的增高损伤逐渐加重。进一步研究发现，DU引起了肾脏组织氧化应激，导致抗氧化能力下降，脂质过氧化水平增高，可能是导致DU肾脏毒性的机制之一。2.3周龄小鼠喂食不同剂量的含DU饲料4个月后，各组血生化检查均无明显异常。在中剂量组（30mg/kg）和低剂量组（3mg/kg），免疫学影响并不明显或影响相对轻微。但在高剂量组（300mg/kg），小鼠的天然免疫功能下降，表现为腹腔巨噬细胞分泌的NO、IL-1、IL-18、TNF-α水平降低，脾脏自然杀伤细胞（natural killer cells，NK cells）的细胞毒性作用降低；小鼠的细胞免疫和体液免疫功能异常，表现为脾脏T细胞增殖能力下降而B细胞的增殖能力提高，血清总IgG、IgE的含量增高，迟发性超敏反应实验显示足跖增厚程度下降；流式细胞术实验发现脾脏mIgM+mIgD+双阳性细胞比例增高，CD3+细胞比例降低，CD4+/CD8+脾脏T细胞的比值降低；ELISA检测发现，脾细胞经过刺激后，释放IFN-γ和TNF-α的水平降低，而释放IL-4和IL-10的水平却增高。以上结果提示，造成高剂量组小鼠免疫功能障碍的原因主要与体内辅助T细胞（Th）1/Th2细胞因子平衡紊乱，引起机体各项免疫功能的调节失常有关。3.线粒体调节的凋亡途径和FasR调节的凋亡途径共同参与了DU引起的HK-2细胞的凋亡过程。而100μM锌预处理可明显抑制DU（500μM）引起的HK-2凋亡，通过降低细胞内活性氧的生成，增加过氧化氢酶（CAT）和还原型谷胱甘肽（GSH）的含量，抑制DU引起的sFasR和sFasL的过表达，抑制线粒体中的细胞色素c和凋亡诱导因子（AIF）释放到胞浆，抑制Caspases-9、Caspases-8和Caspases-3的激活以及促进了金属硫蛋白的表达。进一步观察发现，外源性金属硫蛋白也具有很好的抗DU引起的凋亡的作用。本研究结果证实了，锌通过一些独立的机制抑制了DU引起的凋亡，包括抗氧化效应、抑制Caspases-9、Caspases-8和Caspases-3的激活，并且金属硫蛋白可能参与了锌抗DU引起的凋亡过程。4.锌预处理（10mg/kg）对急性DU中毒（10mg/kg）具有明显的解毒作用，明显提高了大鼠暴露于DU后30d的存活率，使暴露于DU4d后的尿铀含量增加，肝、脾、肾铀含量降低，血清BUN、Cr及尿液NAG显著降低，并使血清IL-6和TNF-α、肾脏组织金属硫蛋白MT-1、MT-2的基因表达水平明显增高，CAT含量增高，丙二醛（MDA）含量降低，病理学损伤减轻。进一步使用锌预处理MT-/-小鼠和MT+/+小鼠，发现MT+/+小鼠的铀含量明显降低，且肾脏损伤明显减轻，抗氧化能力增强；但锌预处理对MT-/-小鼠却没有明显的DU解毒效果。外源性MT的不同基因型（MT1和MT2）对DU解毒效果的研究发现，MT1和MT2均可降低MT-/-小鼠肾脏的铀含量，且MT-1可使肾脏的病理损伤明显减轻，抗氧化能力增强，而MT2的保护效果却并不明显。因此，锌的解毒作用与诱导MT的合成有关，一方面，MT可促进DU的排出；另一方面，MT可增强体内的抗氧化能力，拮抗DU对组织的损伤，并且MT1的作用更加明显。5. MT-/-小鼠和MT+/+小鼠暴露于DU后，利用蛋白组学方法对小鼠肾脏组织蛋白的改变进行研究，发现有13个差异表达蛋白，它们的主要功能集中在糖和脂肪酸的代谢、电子传递呼吸链以及抗氧化防御系统等方面。进一步分析发现，超氧化物歧化酶（SOD）、氨基酰化酶-3（ACY-3）在暴露于DU后明显降低，且MT-/-小鼠降低更为明显，提示了这些蛋白可能参与了DU引起的肾脏中毒过程。采用免疫印迹技术对典型的差异蛋白SOD和ACY-3的表达量进行验证，所得结果与蛋白组学研究结果相吻合，再次验证了贫铀肾毒性的机制之一是引起氧化应激，并且ACY-3可能是DU发挥肾毒性的新的靶点，而MT可通过调节它们的含量在一定程度上减轻肾脏损伤。